背景[1-3]
3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)ELISA试剂盒用于定量人血清、血浆及相关液体样本中3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)的含量。
3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)ELISA试剂盒
检测原理：
本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)含量。
操作步骤：
1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。
4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7、温育：重复4的操作。
8、洗板：重复5的操作。
9、显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，37℃避光显色15min。
10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。
12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。*终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
应用[4][5]
用于S1P3 siRNA对自发性高血压大鼠勃起功能的影响研究
探讨携带S1P3 siRNA慢病毒载体阴茎海绵体内注射的方式进行转染能否通过影响S1P3、eNOS、ROCK1、ROCK2蛋白表达,改善自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rat,SHR）大鼠勃起功能。目前尚无在体实验研究S1P3 siRNA对阴茎组织RhoA/Rho激酶信号通路的作用,并且携带S1P3 siRNA慢病毒载体对勃起功能的影响目前亦不清楚。
故本次实验先成功构建慢病毒转染模型,通过阴茎海绵体内注射的方法进行转染,从而在动物活体水平,验证携带S1P3 siRNA慢病毒载体对SHR大鼠阴茎海绵体组织S1P3、eNOS、ROCK1、ROCK2蛋白表达及勃起功能的影响。方法:本次实验所用动物均为12周龄健康雄性大鼠,分组:正常血压对照组（A组）:5只WKY,将15只SHR随机分组（每组5只）:SHR阳性病毒组（B1组）;SHR阴性病毒组（B2组）,剩下的为C组。会阴部备皮消毒后用适当浓度的巴比妥钠麻醉。暴露阴茎海绵体中部,B1组注射siRNA阳性病毒（滴度1×108）,每侧10ul,B2组相同部位注射等剂量等滴度的阴性病毒,每侧10ul。
饲养一周后,在机能实验室内,称重并采用前述方法进行腹腔麻醉。大鼠手术台上用橡皮筋、尼绒线固定四肢、尾巴,并于阴囊根部打结。打开腹腔暴露下腹腔的膀胱、精囊等组织,盆神经节（major pelvic ganglion,MPG）位于前列腺、直肠沟内。游离并暴露左侧颈总动脉。启动RM6240程序,肝素生理盐水肝素化所有管道,定标、调零后在同一水平线静脉留置针置于左侧颈总动脉,24G细针头穿刺阴茎海绵体远端,穿刺时避开龟头,先右侧后左侧,从远端向近端穿刺,避免血肿。穿刺成功后,程序自动显示瞬时海绵体内压（Intral Cavernosum Pressure）、即刻有创动脉血压（Intral Arterial Pressure）、平均动脉压（Mean Arterial Pressure）。ICPmax/MAP代表勃起指数。数值平稳后行电刺激,在程序中设置电压、波幅、频率等参数:0V、3V、5V,5ms,12Hz。
电刺激器正极尖端接触MPG。在三个电压下,刺激约45s,休息约5min。各组大鼠ICPmax/MAP值测量完毕后,冻存管收集阴茎海绵体标本,液氮浸泡后于-130度冰箱冻存;通过静脉留置针采心脏血,暂常温保存于离心管,待各组大鼠心脏血采集完毕后,统一离心取血清,用于睾酮（tesosterone,T）水平检测。随机取每组大鼠阴茎海绵体部分组织用于冰冻切片至截面积,裱于玻片中央后在避光室内进行DAPI染色。打开cellsence系统、共聚焦荧光显微镜,“1”通道下激发光为紫外光,视野中的蓝点为细胞核;“4”通道下激发光为蓝光,视野中的绿点为GFP表达阳性的细胞核。高倍镜下同一组织片同一视野中总绿点数除以总蓝点数即转染率（Transfective Index,TI）。免疫组化、Western-blot、RT-qPCR检测S1P3、ROCK1、ROCK2、eNOS mRNA及蛋白在大鼠阴茎海绵体中的表达。
参考文献
[1]Exercise training causes a partial improvement through increasing testosterone and eNOS for erectile function in middle-aged rats[J].Dae Yun Seo,Sung Ryul Lee,Hyo Bum Kwak,Hyuntea Park,Kyo Won Seo,Yeon Hee Noh,Kang-Moon Song,Ji-Kan Ryu,Kyung Soo Ko,Byoung Doo Rhee,Jin Han.Experimental Gerontology.2018
[2]Changes in plasma aldosterone and electrolytes levels,kidney epithelial sodium channel（ENaC）and blood pressure in normotensive WKY and hypertensive SHR rats following gonadectomy and chronic testosterone treatment[J].Su Yi Loh,Nelli Giribabu,Naguib Salleh.Steroids.2017
[3]The herbal formula KH-204 is protective against erectile dysfunction by minimizing oxidative stress and improving lipid profiles in a rat model of erectile dysfunction induced by hypercholesterolaemia[J].Hoon Jang,Woong Jin Bae,Su Jin Kim,Hyuk Jin Cho,Seung Mo Yuk,Dong Seok Han,Chang Shik Youn,Eun Bi Kwon,Sung Yeoun Hwang,Sae Woong Kim.BMC Complementary and Alternative Medicine.2017(1)
[4]Cardiovascular and Metabolic Consequences of Testosterone Supplements in Young and Old Male Spontaneously Hypertensive Rats:Implications for Testosterone Supplements in Men[J].Carolina Dalmasso PhD,Chetan N.Patil PhD,Licy L.Yanes Cardozo MD,Damian G.Romero PhD,Rodrigo O.Maranon MD,PhD.Journal of the American Heart Association.2017(10)
[5]陈建国.S1P3 siRNA对自发性高血压大鼠勃起功能的影响[D].西南医科大学,2019.