急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种常见的突发且严重的临床事件，其特点是肾功能迅速丧失和进展的慢性纤维化，发病率和死亡率高[1]。临床上，缺血再灌注（Ischemia-reperfusion，IR）损伤是导致AKI的主要原因之一[2,3]。目前，还没有确证有效可以预防或减弱AKI的药物[4]。
IR破坏细胞氧化还原稳态，触发肾脏中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量生成，造成线粒体损伤，导致炎症、凋亡和坏死[5]。因此，ROS是治疗IR诱导AKI的潜在关键靶点之一。核因子红系因子2相关因子2（nuclear factor erythroid factor-2-related factor 2，Nrf2）通过调节抗氧化基因的表达在许多炎症和氧化应激条件下发挥保护作用[6,7]，研究表明，Nrf2通过抑制氧化应激可显著减轻脑、心、肝脏、肾脏IR损伤[8-11]。
甲基丁香酚（methyl eugenol，ME）是酚类化合物丁香酚的类似物，是许多芳香植物的天然成分，具有抗癌、抗炎、抗菌、镇痛和抗焦虑性等作用，此外，ME可诱导Nrf2活化[12]，表明ME在肾脏氧化应激损伤中可能发挥作用。
2022年7，华中科技大学同济医学院附属同济医院宫念樵教授课题组在Acta Pharmacologica Sinica发表了题为“Methyl eugenol protects the kidney from oxidative damage in mice by blocking the Nrf2 nuclear export signal through activation of the AMPK/GSK3β axis”的文章，揭示了ME通过活化AMPK/GSK3β轴，促进Nrf2核内聚集，进而减轻IR诱导的肾脏氧化应激损伤；ME干预可显著抑制急性氧化损伤后的进行性肾纤维化。该研究为应用ME预防氧化应激相关疾病，特别是为肾脏IR损伤的治疗提供了新的见解和深入的理论依据。
研究者首先检测了不同给药剂量条件下ME对AKI的保护效果，通过检测小鼠肾功能改变，确定有效且相对安全的给药剂量（20 mg/kg）后，观察各组小鼠生存率发现，治疗组可显著提高IR诱导的AKI小鼠生存率、减轻急性肾小管坏死、降低肾损伤相关分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）的表达（图1）。
图1 ME减轻肾脏IR损伤
（图源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
为了验证ME对肾脏氧化应激的作用，课题组检测了干预组与非干预组小鼠肾脏氧化应激水平，结果表明，IR损伤会引起显著氧化应激及线粒体损伤，而ME干预可明显降低8-OhdG荧光强度及肾组织中MDA含量，提高SOD活性，减轻线粒体损伤（图2）。
图2 ME减轻IR诱导的肾脏氧化应激损伤
（图源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
此外，课题组在体外的HK-2细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤模型中，同样发现ME预处理可显著减轻H/R损伤诱导的氧化应激损伤，稳定线粒体膜电位，减少细胞凋亡。为验证ME是否通过Nrf2发挥作用，课题组通过对体内、体外模型中Nrf2蛋白水平的检测发现，ME可显著升高Nrf2水平，给予Nrf2的特异性抑制剂ML385可显著抑制Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平，削弱ME的肾脏保护作用。进一步通过蛋白印迹法及Nrf2免疫组化和荧光染色检测Nrf2胞质/胞核蛋白水平，结果显示ME处理可显著提高Nrf2核内蛋白水平（图3）。
图3 ME对肾IR损伤的保护作用依赖于Nrf2的核内聚集
（图源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
Nrf2在细胞核内与活化反应原件结合后促进下游靶基因转录，进而发挥作用。研究表明，作为应激感受器的AMPK可调控GSK3β进而抑制GSK3β/Fyn通路影响的Nrf2核内蛋白水平[13]。为验证ME对AMPK/GSK3β的调控，课题组分别采用AMPK和GSK3β特异性抑制剂复合物C、DIF-3进行干预，结果表明ME可促进AMPK的磷酸化，导致GSK3β磷酸化进而抑制Nrf2的出核。油红O脂肪染色及LC3/LAMP1双荧光染色进一步表明，ME可调控AMPK进而正向调控脂质氧化及自噬。分子对接结果显示，ME可与AMPK高亲和力结合。以上结果表明，ME通过AMPK/GSK3β通路发挥肾脏保护作用，AMPK可能是ME的潜在作用靶点（图4）。
图4 ME活化AMPK/GSK3β轴，阻断Nrf2出核，进而发挥保护作用
（图源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
临床上温和的、可逆的AKI更为常见，为此，课题组建立了缺血25min的非致死的肾损伤模型，观察ME的治疗效果。动态观察小鼠肾脏功能，结果显示，ME干预组小鼠肾功能恢复明显快于模型组，ME干预可显著降低术后第30天小鼠肾脏α平滑肌肌动蛋白水平，减轻肾脏纤维化面积（图5）。
图5 ME减轻IR诱导的肾脏纤维化进展
（图源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
图6 ME与AMPK高亲和力结合，激活AMPK/GSK3β轴，导致Nrf2核内聚集，从而增强其下游抗氧化基因转录，减轻肾脏氧化应激损伤。
（图源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
文章结论与讨论，启发与展望
综上所述，该研究证明了甲基丁香酚（ME）通过AMPK/GSK3β轴调控Nrf2的胞质-核转位，导致Nrf2核内聚集，从而增强其抗氧化靶基因转录以保护肾脏免受氧化损伤（图6）。本研究为应用ME预防氧化应激相关疾病，特别是为肾脏缺血再灌注IR损伤的治疗提供了新的见解和深入的理论依据。另外，Nrf2核内聚集也受到其他信号通路的影响，既往研究报道Nrf2 N端Neh2结构域Ser40位点磷酸化可促进Keap1/Nrf2ME解离和Nrf2核转位[14,15]，该研究揭示了ME通过AMPK/GSK3β轴调控Nrf2活性，减轻肾脏氧化应激损伤，然而，Nrf2磷酸化水平及ME与AMPK的直接作用位点尚未深入研究；ME能否靶向Nrf2负调控因子Keap1并影响其活性，尚需进一步研究。
参考文献
[1] LEVEY AS, JAMES MT. Acute Kidney Injury[J]. Ann Intern Med. 2017;167(9):Itc66.
[2] FUNK JA, SCHNELLMANN RG. Persistent disruption of mitochondrial homeostasis after acute kidney injury[J]. Am J Physiol Renal Physiol. 2012;302(7):F853.
[3] BONVENTRE JV, WEINBERG JM. Recent advances in the pathophysiology of ischemic acute renal failure[J]. J Am Soc Nephrol. 2003;14(8):2199.
[4] MICHELSEN J, CORDTZ J, LIBORIUSSEN L, et al. Prevention of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury - A DASAIM/DSIT clinical practice guideline[J]. Acta Anaesthesiol Scand. 2019;63(5):576.
[5] YU H, JIN F, LIU D, et al. ROS-responsive nano-drug delivery system combining mitochondria-targeting ceria nanoparticles with atorvastatin for acute kidney injury[J]. Theranostics. 2020;10(5):2342.
[6] DIAO C, CHEN Z, QIU T, et al. Inhibition of PRMT5 Attenuates Oxidative Stress-Induced Pyroptosis via Activation of the Nrf2/HO-1 Signal Pathway in a Mouse Model of Renal Ischemia-Reperfusion Injury[J]. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:2345658.
[7] TU W, WANG H, LI S, et al. The Anti-Inflammatory and Anti-Oxidant Mechanisms of the Keap1/Nrf2/ARE Signaling Pathway in Chronic Diseases[J]. Aging Dis. 2019;10(3):637.
[8] TANG C, HONG J, HU C, et al. Palmatine Protects against Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury by Activation of the AMPK/Nrf2 Pathway[J]. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:6660193.
[9] DUAN J, GUAN Y, MU F, et al. Protective effect of butin against ischemia/reperfusion-induced myocardial injury in diabetic mice: involvement of the AMPK/GSK-3β/Nrf2 signaling pathway[J]. Sci Rep. 2017;7:41491.
[10] WU Y, QIU G, ZHANG H, et al. Dexmedetomidine alleviates hepatic ischaemia-reperfusion injury via the PI3K/AKT/Nrf2-NLRP3 pathway[J]. J Cell Mol Med. 2021;25(21):9983.
[11] ZHANG J, ZHANG J, NI H, et al. Downregulation of XBP1 protects kidney against ischemia-reperfusion injury via suppressing HRD1-mediated NRF2 ubiquitylation[J]. Cell death discovery. 2021;7(1):44.
[12] ZHOU J, MA X, CUI Y, et al. Methyleugenol protects against t-BHP-triggered oxidative injury by induction of Nrf2 dependent on AMPK/GSK3beta and ERK activation[J]. J Pharmacol Sci. 2017;135(2):55.
[13] LV H, LIU Q, WEN Z, et al. Xanthohumol ameliorates lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury via induction of AMPK/GSK3beta-Nrf2 signal axis[J]. Redox Biol. 2017;12:311.
[14] BLOOM DA, JAISWAL AK. Phosphorylation of Nrf2 at Ser40 by protein kinase C in response to antioxidants leads to the release of Nrf2 from INrf2, but is not required for Nrf2 stabilization/accumulation in the nucleus and transcriptional activation of antioxidant response element-mediated NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1 gene expression[J]. J Biol Chem. 2003;278(45):44675.
[15] ZHUANG Y, WU H, WANG X, et al. Resveratrol Attenuates Oxidative Stress-Induced Intestinal Barrier Injury through PI3K/Akt-Mediated Nrf2 Signaling Pathway[J]. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:7591840.