背景[1-3]
苹果酸脱氢酶(MDH)测定试剂盒(测组织)(紫外比色法)可测动物组织、植物组织及培养细胞样本中苹果酸脱氢酶活力。
苹果酸脱氢酶（Malate Dehydrogenase,MDH）催化的氧化还原反应伴随着340nm处吸光度的降低，通过测定每分钟吸光度的变化来计算苹果酸脱氢酶的活力。MDH与植物代谢的多条重要途径有密切关系，它在运转物质和能量的Mal/OAA（苹果酸/草酰乙酸）和Mal/Asp（苹果酸/天冬氨酸）穿梭中起重要作用；在光呼吸中，MDH为Gly（甘氨酸）氧化提供NAD+；在线粒体中，MDH还是决定TCA(三羧酸循环)运转速度的调节酶之一；在细胞溶质中，MDH与丙酮酸支路相联系。所以MDH系统不仅是研究酶区域化和酶调节的好系统，也为研究各细胞器之间的联系和许多发育问题提供了方便。
苹果酸脱氢酶(MDH)
产品优点如下：
快速简便：速率法操作全程约5分钟,可做5-10个样本
稳定性好：试剂盒－20℃冷冻保存6个月有效。
再现性好：变异系数CV=1.2%。
回收试验：X=102%。
受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。
测试面广：可测动物组织、培养细胞、植物组织、各种水产等，效果均佳。
所需仪器及自备试剂：
1、分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为440nm）
2、恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
3、漩涡混匀器
4、微量移液器
应用[4][5]
用于海洋微生物苹果酸脱氢酶的基因表达和发酵过程优化研究
苹果酸脱氢酶（MDH）是一种氧化还原酶,其正反应可催化L-苹果酸和辅酶NAD+氧化形成草酰乙酸,逆反应可催化草酰乙酸以及辅酶NADH合成L-苹果酸。同时MDH在食品、临床医药和农业生产等领域,都具有非常重要的应用。由于目前国内的MDH酶制剂价格昂贵,且大多来自于动物心脏,存在提取复杂且容易造成环境污染等问题,故从丰富的海洋微生物中,提取MDH具有重要的意义。独特海洋环境造就具有耐盐、嗜热、嗜冷、耐压和耐酸、耐碱等特性的极端酶。
海洋微生物在新基因、新蛋白开发等方面的应用潜力极大,为从海洋菌株中挖掘MDH基因,并构建相应的工程菌株,从而进行以下实验:（1）目标菌株的筛选。从实验室保存的14株由国家海洋局第三研究所馈赠的海洋菌菌株出发,筛选出1株MDH酶活最高的野生型菌株Pseudomonas beteli。
（2）构建表达MDH的重组大肠杆菌。以Pseudomonas beteli基因组为模板,克隆出MDH基因,并连接至载体pET-28a,转化至E.coli BL21（DE3）和E.coli Rosetta（DE3）,得到表达MDH的工程菌。
（3）MDH酶促反应最适条件和稳定性的考察。重组菌株Rosetta-pET28a-MDH通过诱导,产生目的蛋白MDH并通过镍柱进行蛋白纯化,纯化后MDH的比酶活为31.3U/mg。MDH酶促反应最适温度为60℃,40℃以下孵育1h,酶活都能保持在60%以上。最适酶促反应pH为8.0,40℃孵育1 h,MDH在pH=7.0时最为稳定。
（4）培养基优化。以苹果酸脱氢酶高产菌株Rosetta-pET28a-MDH为发酵菌株,利用PB实验以及均匀设计实验,结合DPS数据处理系统对其培养基组成进行优化,最终确定了其的培养基成分（g/L）:葡萄糖10,酵母粉37.5,磷酸氢二钾8.0,磷酸二氢钠2.5,硫酸铵1.4,EDTA0.5,微量元素1.1。
（5）多阶段调控50L高密度发酵。接种前维持转速200rpm和溶氧值40%左右。阶段:在接种后,采用与通气量偶联的方法调节转速,维持通气量不变,转速最高达500rpm,设置溶氧值为30%,温度37℃。第二阶段:采用与通气量偶联的方法调节通气量,转速维持在500 rpm不变,系统自动调节通气量,设置溶氧值为30%,温度37℃。第三阶段:当发酵液的OD值达到10～11时,加入IPTG,进行诱导,维持转速500 rpm,设置溶氧值为30%,温度20℃。发酵过程中,采用恒pH补料方法,每隔1～2h收集30ml发酵液。测定其OD值最高达15.1,苹果酸脱氢酶的粗酶比酶活和粗酶酶活分别为67.5U/mg和41.0 U/ml,1L的发酵液含有酶活41000U。
参考文献
[1]Partial protective immunity against toxoplasmosis in mice elicited by recombinant Toxoplasma gondii malate dehydrogenase[J].Zhuanzhuan Liu,Fei Yuan,Yanping Yang,Litian Yin,Yisheng Liu,Yanjuan Wang,Kuiyang Zheng,Jianping Cao.Vaccine.2015
[2]Feeding strategies enhance high cell density cultivation and protein expression in milliliter scale bioreactors[J].Georg Faust,Nils H.Janzen,Christoph Bendig,Lin R?mer,Klaus Kaufmann,Dirk Weuster‐Botz.Biotechnology Journal.2014(10)
[3]Directed evolution of thermotolerant malic enzyme for improved malate production[J].Yumi Morimoto,Kohsuke Honda,Xiaoting Ye,Kenji Okano,Hisao Ohtake.Journal of Bioscience and Bioengineering.2014(2)
[4]Complex formation between malate dehydrogenase and isocitrate dehydrogenase from Bacillus subtilis is regulated by tricarboxylic acid cycle metabolites[J].Maike Bartholomae,Frederik M.Meyer,Fabian M.Commichau,Andreas Burkovski,Wolfgang Hillen,Gerald Seidel.FEBS J.2014(4)
[5]苏洁茹.海洋微生物苹果酸脱氢酶的基因表达和发酵过程优化[D].厦门大学,2017.