背景[1][2][3][4][5]
BIRB 796 (p38 MAPK抑制剂)是一种高效的p38α抑制剂，IC50为4 nM，也抑制B-Raf和Abl，IC50分别为83 nM和14.6μM。
由于其在T细胞增殖和细胞因子产生中的作用，通常与炎症相关。Doramapimod（BIRB 796）是人p38 MAP激酶的抑制剂。P38促分裂原活化蛋白激酶是一类有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK），其对应激刺激如细胞因子，紫外线照射，热休克和渗透休克有反应，并参与细胞分化，凋亡和自噬。由于衰老，肌肉卫星细胞（肌肉干细胞）中p38 MAPK通路的持续激活会损害肌肉再生。
p38MAP激酶（MAPK），也称为RK或CSBP（细胞分裂素特异性结合蛋白），是哺乳动物直向同源物的的酵母Hog1p MAP激酶，其参与信号级联控制细胞因子和应力细胞应答。四种的p38 MAP激酶，P38-α（MAPK14）-β（MAPK11）-γ（MAPK12/ERK6），和-δ（MAPK13/SAPK4），也已确定。与SAPK/JNK途径类似，p38 MAP激酶被多种细胞应激激活，包括渗透压休克，炎性细胞因子，脂多糖（LPS），紫外线和生长因子。MKK3和SEK通过在Thr-180和Tyr-182处的磷酸化激活p38 MAP激酶。
已显示活化的p38 MAP激酶磷酸化并激活MAPKAP激酶2并磷酸化转录因子ATF2，Mac和MEF2。p38也已显示磷酸化转录后调节因子如TTP。在用山梨糖醇刺激（渗透压休克）之前，将HEK293细胞与不同浓度的Doramapimod（BIRB 796）孵育30分钟或2小时，并通过测量其活性检查MAPKAP-K2的活化。MAPKAP-K2活化在这些细胞中以时间依赖性方式受到抑制，30分钟后表观IC 50为30 nM或与Doramapimod预培养2小时后8 nM。
Doramapimod（BIRB 796）加紫杉醇组（1.14±0.48 g）的平均异种移植重量轻于对照，Doramapimod或紫杉醇组（1.84±0.61,1.80±0.62和1.65±0.29 g）（P<0.05）在Athymic裸体中小鼠（BALB/c-nu/nu）。Doramapimod，紫杉醇和Doramapimod加紫杉醇的抑制率分别为1.93％，9.93％和38％。重要的是，与对照组，紫杉醇或单独的Doramapimod相比，Doramapimod和紫杉醇的组合可显着抑制肿瘤生长。
Doramapimod（BIRB 796）治疗略微降低血压（第7周166±7 mm Hg;P<0.05），而SD大鼠血压正常（123±3 mm Hg）。尽管血压降低，未治疗和Doramapimod治疗的dTGR具有相似的心脏重量和心脏肥大指数（心脏-胫骨比），与非转基因SD大鼠相比显着更高（310±6对307±6对比206±分别为5 mg/cm;P<0.05）。
研究应用[6]
p38抑制剂BIRB796逆转膜转运蛋白ABCB1介导的肿瘤多药耐药作用及其机制研究。研究方法MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测细胞毒实验；流式细胞仪检测阿霉素、罗丹明123在细胞内的积累；以KBV200细胞建立裸鼠移植瘤模型探讨BIRB796体内逆转活性；蛋白测定用Western blotting法;ABCB1在mRNA表达水平用PCR和RT-PCR法测定；ATPase试剂盒测定BIRB796对ABCB1ATPase活性的影响；瞬时干扰RNA法观察沉默p38后,用MTT法检测紫杉醇对KBV200细胞的细胞毒性；Docking实验模拟BIRB796与ABCB1的结合位点。
结果：本研究通过MTT法证实了p38MAPK抑制剂BIRB796能够特异性的逆转ABCB1所介导MDR,但对ABCG2和ABCC1介导MDR却无逆转作用。通过流式细胞仪检测证明了BIRB796是通过增加ABCB1的底物(罗丹明123和阿霉素)在细胞中的浓度来实现逆转效果的。我们利用高表达ABCB1的KBV200细胞建立MDR裸鼠移植瘤模型,进一步验证了BIRB796在裸鼠体内逆转效果。
Western blot以及PCR/Real time PCR结果显示BIRB796不改变ABCB1在蛋白和mRNA水平的表达。通过Pgp-GloTM试剂盒检测ABCB1ATPase的活性实验证明了BIRB796是通过调节ABCB1的ATP水解酶的活性来从而抑制了ABCB1的外排功能。通过瞬时干扰p38MAPK,证明了p38信号通路对BIRB796逆转ABCB1介导MDR没有协同作用。通过Docking分析发现BIRB796最有可能与ABCB1的位点1结合,并模拟出二者之间的可能存在的分子间相互作用。我们推断分子间的疏水作用最有可能是BIRB796与ABCB1药物结合位点1的原因。
结论：1、BIRB796能够特异性的逆转ABCB1所介导MDR,方式是通过增加ABCB1的底物(罗丹明123和阿霉素)在细胞中的浓度。2、BIRB796对ABCG2和ABCC1无逆转作用.3.BIRB796’恢复KBV200裸鼠移植瘤模型对紫杉醇的敏感性,但并不增加紫杉醇在裸鼠体内的毒性。4、BIRB796不影响ABCB1的蛋白和mRNA水平的影响。5.BIRB796双向调节ABCB1ATPase活性,来实现抑制ABCB1外排功能。6、p38信号通路对BIRB796逆转ABCB1介导的MDR无协同作用。7、Docking分析模拟出BIRB796与ABCB1位点1之间可能存在的分子间相互作用,疏水作用最有可能是二者之间结合的主要原因。
参考文献
[1].Dietrich J,et al.The design,synthesis,and evaluation of 8 hybrid DFG-out allosteric kinase inhibitors:a structural analysis of the binding interactions of Gleevec,Nexavar,and BIRB-796.Bioorg Med Chem.2010 Aug 1;18(15):5738-48
[2].Pargellis C,et al.Inhibition of p38 MAP kinase by utilizing a novel allosteric binding site.Nat Struct Biol,2002,9(4),268-272.
[3].Kuma Y,et al.BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.J Biol Chem,2005,280(20),19472-19479.
[4].He D,et al.BIRB796,the inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase,enhances the efficacy of chemotherapeutic agents in ABCB1 overexpression cells.PLoS One.2013;8(1):e54181.
[5].Park JK,et al.p38 mitogen-activated protein kinase inhibition ameliorates angiotensin II-induced target organ damage.Hypertension.2007 Mar;49(3):481-9.
[6]p38抑制剂BIRB796逆转膜转运蛋白ABCB1介导的肿瘤多药耐药作用及其机制研究[D].何丹.新疆医科大学.2013