背景[1-3]
人正常前列腺基质永生化细胞来源于同一张成人前列腺组织切片的周围区域的基质细胞。通过一个pRSTV质料结构，用SV40大T抗原对基质细胞进行永生化。WPMY-1细胞，与RWPE-1细胞及其它上皮细胞衍生株一样，属于来源于同一个前列腺的一系列细胞株。由于它们来源于同一个前列腺的周围区域，WPMY-1细胞株对于研究分泌和基质与上皮细胞相互作用尤其有用。据提供者报道，来源于同一个前列腺的RWPE-1细胞株(ATCC CRL-11609)，经过检测，乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒都呈阴性。
人正常前列腺基质永生化细胞
人正常前列腺基质永生化细胞培养操作
1）复苏人正常前列腺基质永生化细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人正常前列腺基质永生化细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养；
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将人正常前列腺基质永生化细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人正常前列腺基质永生化细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人正常前列腺基质永生化细胞可以用于LncRNA/BLM对前列腺癌细胞增殖的影响研究
以不同株系前列腺癌细胞(LNCaP、22RV-1)和正常前列腺基质成纤维细胞(WPMY-1)为研究对象,通过qRT-PCR、分子克隆、细胞培养、细胞转染、细胞增殖、划痕实验、Western blot等技术,筛选和鉴定与BLM基因相关的LncRNA BLNC203和BLNC246基因,检测在mRNA水平BLM、BLNC203、BLNC246的表达水平,在蛋白水平检测相关基因BLM的表达差异。
解析在LncRNA的调控下前列腺癌细胞的增殖效应的研究,为进一步研究以BLM解旋酶基因为抗癌靶标药物及早期诊断治疗提供基础科学依据,主要研究结果如下:1.人BLM基因相关LncRNAs的筛选及其在不同细胞中的表达分析通过在线网站NCBI、miRBase、NONCODE(http://www.noncode.org/)及对BLM相关LncRNAs进行筛选鉴定。
结果筛选出与BLM相关的LncRNAs(NONHSAT203515.1 BLNC203)(NONHSAT246735.1 BLNC246),BLNC203长为862 bp,位于5号染色体上;BLNC246长为375 bp位于3号染色体上。两者含有二级结构和开放阅读框。在不同细胞中qRT-PCR结果显示;以正常人的前列腺基质成纤维细胞(WPMY-1)为对照组,BLM在LNCaP、22RV-1细胞中都低于正常细胞,在LNCaP细胞中是极显著低于正常细胞(P<0.01);在22RV-1细胞中是显著低于正常细胞(P<0.05),BLNC203在22RV-1细胞中的表达量都极显著高于正常细胞(P<0.01),在LNCaP细胞中不显著(P>0.05)。BLNC246在LNCaP细胞中表达量都极显著低于正常细胞(P<0.01),在22RV-1细胞中不显著(P>0.05)。推测两基因可能在不同细胞中存在不同的表达现象。
2. 超表达BLNC203、BLNC246对相关基因BLM的影响构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-BLNC203和pcDNA3.1(+)-BLNC246转染至不同株系前列腺癌细胞和正常前列腺细胞中,利用qRT-PCR和Western blot技术检测相关基因BLM的表达水平。
结果显示:在mRNA水平,正常细胞WPMY-1中空载体对照组与试验组中BLNC203、BLNC246基因的表达上调;BLM基因在空载体对照组与试验组中的表达下调。在前列腺癌细胞LNCaP中空白对照组与试验组中BLNC203、BLNC246基因表达上调,BLM基因在空载体对照组与试验组中的表达仍然上调;在前列腺癌细胞22RV-1中空白对照组与试验组中BLNC203、BLNC246基因的表达上调,BLM基因在空载体对照组与试验组中的表达量是上调。在蛋白水平上,在前列腺癌细胞22RV-1中当超表达BLNC203、BLNC246后,BLM基因的表达量与空载体pcDNA相比表达量上调;在前列腺癌细胞LNCaP细胞中当超表达BLNC203、BLNC246后,BLM基因的表达量与空载体pcDNA相比表达量上调;在正常前列腺基质成纤维细胞WPMY-1中,当超表达BLNC203、BLNC246后,BLM基因的表达量下调。在超表达BLNC203和BLNC246后在mRNA水平和蛋白水平BLM基因在正常细胞中的表达下调,在前列腺癌细胞中则是上调。在mRNA水平与蛋白水平表达模式则保持一致。
3. 超表达BLNC203和BLNC246对细胞增殖能力和迁移的影响构建成功的超表达载体pcDNA3.1(+)-BLNC203和pcDNA3.1(+)-BLNC246转染至不同株系前列腺癌细胞和正常前列腺细胞中,采用划痕实验检测细胞的迁移能力,CCK8检测细胞的增殖能力。
结果显示,在划痕实验中前列腺癌细胞LNCaP和22RV-1在48 h的迁移效果最强,CCK8实验检测细胞的增殖效应显示当超表达BLNC203和BLNC246后与pcDNA空载体相比则是促进了细胞的增殖。
参考文献
[1]Maintenance of Yeast Genome Integrity by RecQ Family DNA Helicases[J].Sonia Vidushi Gupta;;Kristina Hildegard Schmidt.Genes,2020(2)
[2]Cancer statistics,2020.[J].Siegel Rebecca L;;Miller Kimberly D;;Jemal Ahmedin.CA:a cancer journal for clinicians,2020(1)
[3]Long non-coding RNA CHRF promotes proliferation and mesenchymal transition(EMT)in prostate cancer cell line PC3 requiring up-regulating microRNA-10b.[J].Liu Shuang;;Wang Lin;;Li Yongwei;;Cui Yuanshan;;Wang Yongqiang;;Liu Chu.Biological chemistry,2019(8)
[4]LncRNA MEG3 inhibits the progression of prostate cancer by modulating miR-9-5p/QKI-5 axis.[J].Wu Meng;;Huang Yawei;;Chen Tongchang;;Wang Weichao;;Yang Shiguang;;Ye Zhenfeng;;Xi Xiaoqing.Journal of cellular and molecular medicine,2019(1)
[5]罗斌杰.LncRNA/BLM对前列腺癌细胞增殖的影响研究[D].贵州大学,2021.