背景[1-3]
人组织因子途径抑制物(TFPI)Elisa试剂盒采用双抗体夹心两步法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人组织因子途径抑制物(TFPI)抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人组织因子途径抑制物(TFPI)校准品和待测样本，再加入生物素标记抗体，经过温育与充分洗涤后，再加入HRP偶联的亲和素，经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-生物素标记抗体-亲和素酶的夹心复合物。加显色液TMB，产生蓝色产物，在终止液作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人组织因子途径抑制物(TFPI)的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人组织因子途径抑制物(TFPI)的浓度。
人组织因子途径抑制物(TFPI)Elisa试剂盒
人组织因子途径抑制物(TFPI)ELISA试剂盒样品的准备和保存：
细胞培养上清—离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清—用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆—采用肝素、柠檬酸盐或EDTA抗凝，抽血后30分钟内在2-8℃离心2000×g 20分钟。为消除血小板的影响，建议在2-8℃进一步离心10000×g 10分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞裂解液—对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000—14000×g离心3-5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
尿液—用无菌管收集，离心2000×g 20分钟。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
人组织因子途径抑制物(TFPI)ELISA试剂盒操作程序：
1、所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
2、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本稀释液孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗体100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育60min。
4、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
5、除空白孔外，每孔加入HRP标记亲和素100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育20min。
6、重复步骤4。
7、所有孔中加入底物显色液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育15min。
8、所有孔加入终止液50μL，在450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
应用[4][5]
人组织因子途径抑制物(TFPI)Elisa试剂盒可以用于组织因子基因沉默对胎盘早剥HUVECs的影响
在原代培养脐静脉内皮细胞的基础上，建立组织因子基因干扰载体系统，利用近年来发展起来的RNAi技术，分别对胎盘早剥和正常出生的新生儿脐静脉内皮细胞的组织因子表达进行干预，将构建的组织因子干扰载体转染进入脐静脉血管内皮细胞，沉默内皮细胞组织因子表达，为进一步的基因治疗打下基础。
方法1、按照试剂盒说明书，采用人组织因子途径抑制物(TFPI)Elisa试剂盒以正常分娩作为对照，测定胎盘早剥产妇血、脐血及所生新生儿血TF、TFPI，并计算出TFPI／TF的值。2、HUVECs的体外培养和鉴定：无菌剪取刚分娩的脐带约10cm，挤去脐带血管中的血液，PBS反复冲洗掉脐带外及末端血迹，再用PBS 20～40ml持续冲洗脐静脉腔，至流出的液体无色或淡洗肉水色，0.1％胶原酶Ⅱ5～10ml，灌入脐静脉，37℃孵育消化12min，收集消化液再用PBS约20ml反复冲洗脐静脉，加入胎牛血清终止消化，将收集液1000r／min×10min，常温离心，弃上清，在收集细胞沉淀中加入完全培养基，反复吹打使细胞团成为单个细胞，接种至25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2，培养24h后观察，见较多细胞贴壁伸展生长，成梭形或三角形，换液，再加入含有表皮生长因子（Edothenial grouth factor，EGF）培养48～72小时至细胞基本长满培养瓶，应用免疫组织化学法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定，取第2、3代细胞用于实验。
参考文献
[1]Comparison of Gene Silencing in Human Vascular Cells Using Small Interfering RNAs[J].Nicholas D.Andersen;;Thomas S.Monahan;;Junaid Y.Malek;;Monica Jain;;Soizic Daniel;;Lena D.Caron;;Leena Pradhan;;Christiane Ferran;;Frank W.LoGerfo.Journal of the American College of Surgeons,2007(3)
[2]Intertwining of thrombosis and inflammation in atherosclerosis[J].Kevin Croce;;Peter Libby.Current Opinion in Hematology,2007(1)
[3]Indole-3-carbinol alters placental cytochrome P450 1A1 and P-glycoprotein levels in rats:A potential role in intensifying fetal intrauterine growth-retardation produced by tobacco smoke[J].You-E Yan;;Hui Wang;;Ting Wang;;Han-Gao Zeng.Experimental and Toxicologic Pathology,2006(1)
[4]Maternal-fetal conditions necessitating a medical intervention resulting in preterm birth[J].Cande V.Ananth;;Anthony M.Vintzileos.American Journal of Obstetrics and Gynecology,2006(6)
[5]唐雯.组织因子基因沉默对胎盘早剥HUVECs的影响[D].南方医科大学,2007.