现行有效的脂肪酶活力检测方法《粮油检验粮食、油料的脂肪酶活动度的测定》(GB/T 5523-2008)中仅针对粮食与油料作物，未提到乳制品检测方法。通过查阅大量文献，目前有学者采用比色法与荧光法直接测量脂肪酶活力，多数采用棕榈酸对硝基苯酯(p-Nitrobenzene Palmitate,p-NPP)法检测脂肪醇活力。在脂肪酶的作用下，棕榈酸对硝基苯酯会分解产生对硝基苯酚，其浓度与脂肪酶活力成正比。
依胜男等人使用棕榈酸对硝基苯酯法用于脂肪酶活性检测，由于牛奶呈乳白色，按照文献方法，无法获得澄清样品，背景值高导致酶标仪无法准确读数，不能用于牛乳中脂肪酶活性检测。
方法
1、溶液的配制
1mol/L柠檬酸钠溶液:准确称取29.41g柠檬酸钠，用超纯水定容至100mL。
50mmol/L Tris-HCI缓冲液:95mL 1mol/L柠檬酸钠溶液中加入5mL 1mol/L Tris-HCI溶液，用盐酸(6mol/L)调整pH至7。
1mmol/L对硝基苯棕榈酸酯溶液:用二甲基亚砜配制。
1mmol/L对硝基苯酚溶液:用50mmol/L Tris-HCI缓冲液配制。
100U/mL脂肪酶溶液:用超纯水配制。
终止液:将乙腈与甲酸按照1:12的比例混合。
2、标准曲线的绘制
以50mmol/L Tris-HCI缓冲液为溶剂，用1mmol/L对硝基苯酚溶液分别配制浓度为0、10、20、40、80、100、200、400、800umol/L的对硝基苯酚标准溶液，分别取该标准溶液200uL于96孔酶标板中，测量405nm处的吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，标准溶液浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。以对硝基苯酚浓度为零的溶液作为空白对照。
3、样品前处理
将缓冲液与样品按照1:3混合于离心管中;涡旋3s~5s后室温放置30min;在4℃下以12000r/min离心3min;除去上层脂肪层，取下层澄清溶液备用(离心后及时吸取，防止脂肪层下沉)。
4、脂肪酶活力检测
加350uL 1mmol/L棕榈酸对硝基苯酯溶液于2mL离心管中，再加入300uL澄清提取液，最后加300uL 50mmol/L Tris- HCI缓冲液，即为反应体系;于40℃下，150r/min振荡孵育30min，加入50uL终止液，混匀冷却;
在25℃下以12000r/min离心3min;吸取200uL澄清溶液于96孔酶标板中，在405nm波长下测量吸光值(以不加1mmol/L棕榈酸对硝基苯酯溶液的样品作为样品空白进行检测)。单位时间内水解棕榈酸对硝基苯酯释放1umol对硝基苯酚的酶活性定义为一个酶活单位U，计算公式见下图：
参考文献
[1]郭雨晴,闫青,关宁,等. 对硝基苯棕榈酸酯法测定牛乳中脂肪酶活力方法研究[J]. 饮料工业,2024,27(6):31-35. DOI:10.3969/j.issn.1007-7871.2024.06.006.