不饱和直链烃例如α-链烯或1-烯烃是工业上重要类型的分子,除了在燃料中使用外,其可以充当润滑剂和表面活性剂。相比化合合成,有机化学物质的生物合成可以提供高效的选择性。因而，存在着对微生物菌株的需求,所述菌株可以产生提高产量的烃类,特别是末端烯烃。1-十九碳烯作为一种末端烯烃，在有机合成中的中间体，在合成润滑剂、表面活性剂和其他化学品中发挥着重要的作用。1-十九碳烯为无色液体，可溶于有机溶剂，不溶于水。
生物合成[1]
聚球蓝细菌属物种PCC 7002的敲除菌株的制备：在含有200mg/L壮观霉素的A+培养基中的5ml培养物在150rpm在37℃在2% CO2/空气和连续光照(70-130μE m2/s PAR,用LI-250A光度计(LI-COR)测量的)下在Infors摇动孵化器中孵育,直到它的OD730达到1。对于每种质粒,将500ul的培养物和5ug质粒DNA添加到微离心管中。试管然后在250rpm在New Brunswick摇动孵化器中在37℃在暗处孵育4h。每个转化250ul然后接种在A+琼脂平板上。平板在恒定的照明下在37°C下中Percival灯照孵化器中孵育约24小时过夜。在第二天,将庆大霉素溶液添加到平板的琼脂的下方到最终估计的25mg/L庆大霉素浓度。将这些平板放回到孵化器中直到显现细小的菌落。将平板移动到处于相同条件下,只是在空气中维持1%CO2的另一个Percival孵化器中(容许更快的生长)。来自每个转化平板的两个菌落在含有50mg/L庆大霉素的A+平板上划线,在 Percival孵化器(环境CO2浓度)中孵育直到出现菌落。
培养物在Infors孵化器中在~100uEm-2s-1光合活性辐射(PAR)的连续光照下在37°C在150rpm在2% CO2富集空气中孵育四天。通过添加回milli-Q水来补偿水分流失。进行730nm(OD730)处的光密度测量。取出2.5ml的每种培养物,细胞使用Sorvall RC6Plus超高速离心机和F13S-14X50CY转子(5000rpm 10分钟)来团粒化。移除培养基上清液，细胞重悬浮在1ml Milli-Q水中。细胞再一次使用台式离心机来团粒化，丢弃上清液，细胞团粒保存在-80℃等待分析1-十九碳烯的存在。
1-十九碳烯的检测和定量
解冻细胞团粒,添加含有100ml/L丁基化羟基甲苯(Sigma-Aldrich B1378)和50mg/L花生酸乙酯(Sigma A9010)的1ml等分量的丙酮(Acros Organics 326570010)。细胞团粒涡旋15秒两次(整个提取时间1-2分钟)。悬浮液离心2分钟来团化碎屑,利用火焰电离检测(GC/FID)或质谱检测(GC/MS)用气相色谱仪来分析上清液。
装备有7683系列自动进样器的Agilent 7890A GC/5975C EI-MS被用于确认1-十九碳烯的身份。1uL的每种样品使用脉冲的不分流注射(压力:20psi,脉冲时间:0.3分钟,吹扫时间:0.2分钟,清洗气流:15mL/分钟)来注射到GC进口中,进口温度280℃。柱是HP-5MS(Agilent,30mx0.25mmx0.25um),运载气体是1.0mL/分钟流动的氦气。GC烘箱温度程序是50℃保持一分钟;10℃/分钟提高到280 ℃,保持十分钟。GC/MS接口是290℃,监视的MS范围是25到600amu。JCC138的提取物中存在的峰具有与商业上可获得的1-十九碳烯标准物(Fluka 74320)相同的保留时间(17.5分钟)和质谱,确认了这个菌株的1-烯烃的生产。
装备有7683系列自动进样器的gilent 7890A GC/FID被用于定量1-十九碳烯。1uL的每种样品来注射到GC进口中(分流5:1,压力:20psi,脉冲时间:0.3分钟,吹扫时间:0.2分钟,清洗气流:15mL/分钟),进口处在280℃的温度下。柱是HP-5MS(Agilent,30mx0.25mmx0.25um),运载气体是1.0mL/分钟流动的氦气。GC烘箱温度程序是50℃保持一分钟;10℃/分钟提高到280℃,保持十分钟。使用1-十九碳烯标准物(rt 18.8)构建标准曲线,测定提取物中的浓度并标准化为花生酸乙酯(内标准物)的浓度[1]。
参考文献
[1]焦耳无限科技公司. 在工程化的微生物中的1-烯烃的生物合成:CN201080037536.0[P]. 2012-07-11.