背景[1-3]
DAMI人巨核细胞白血病细胞从一个巨核细胞白血病患者的血液建立了一株新的人类巨核细胞(Dami)。此细胞悬浮生长为主，倍增时间24-30小时。至少89%的细胞可与血小板糖蛋白(GP)lb and Ilb/llla及血型糖蛋白单克隆抗体反应。不与抗淋巴腺、单核细胞、粒性白细胞、巨噬细胞抗原的抗体反应。Dami细胞为研究巨核细胞生化及分化提供了极好的模型。
DAMI人巨核细胞白血病细胞
一．DAMI人巨核细胞白血病细胞培养基及培养冻存条件准备
1）准备RPMI-1640（推荐iCell-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%
注：细胞生长以悬浮为主、会有少量贴壁现象。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．DAMI人巨核细胞白血病细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）DAMI人巨核细胞白血病细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。
该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：
1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）DAMI人巨核细胞白血病细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
下面T25瓶为例；
1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.
2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
应用[4][5]
DAMI人巨核细胞白血病细胞可以用于活血胶囊通过p38激活ADAM17调控血小板膜受体的实验研究
探讨HXJN对血小板中肿瘤坏死因子-α转化酶(Tumor necrosis factor-αconverting enzyme,TACE,即ADAM17)的活化作用,以及基于ADAM17调控血小板膜受体GPIbα的信号通路作用,并进一步阐明HXJN作用于血小板的关键环节和分子机制,为活血化瘀中药复方和单体的研究提供新的方向。
方法:体外培养DAMI人巨核细胞白血病细胞或分离人新鲜血小板,通过富血小板血浆吉姆萨染色评估分离血小板的质量,再给予不同浓度或不同时间HXJN水提物溶液处理,采用ELISA法检测细胞培养液或富血小板血浆上清中GPIbα胞外片段(Glycocalicin,GC)的含量变化;收集细胞裂解液,采用Western Blot技术检测细胞中p-TACE/TACE、p-p38、GPIbα的表达水平变化;采用荧光法检测细胞中TACE酶活性的变化。
结果:(1)分离出的血小板通过吉姆萨染色后观察,血小板生理状态及功能良好可进一步实验;(2)HXJN诱导血小板中ADAM17酶活性明显升高,且这种升高可被抑制剂TAPI-1显著抑制;(3)随着HXJN作用时间的延长及浓度的递增,DAMI人巨核细胞白血病细胞培养上清或富血小板血浆中GPIbα胞外片段GC含量迅速而显著升高;(4)HXJN诱导血小板及DAMI细胞中p-TACE(Thr735)和p-p38表达水平随时间显著升高;(5)p38抑制剂对HXJN诱导的GC含量升高有显著抑制作用。
参考文献
[1]Functions of p38 MAP Kinases in the Central Nervous System.[J].Asih Prita R.;Prikas Emmanuel;Stefanoska Kristie;Tan Amanda R.P.;Ahel Holly I.;Ittner Arne.Frontiers in molecular neuroscience.2020
[2]Interplay between platelets and coagulation[J].Yaqiu Sang;;Mark Roest;;Bas de Laat;;Philip G.de Groot;;Dana Huskens.Blood Reviews.2020
[3]IL-33 promotes type 1 cytokine expression via p38 MAPK in human NK cells.[J].Ochayon David E;;Ali Ayad;;Alarcon Pablo C;;Krishnamurthy Durga;;Kottyan Leah C;;Borchers Michael T;;Waggoner Stephen N.Journal of leukocyte biology.2020
[4]Dendritic Cell-Restricted Progenitors Contribute to Obesity-Associated Airway Inflammation via Adam17-p38 MAPK-Dependent Pathway.[J].Jaiswal Anil Kumar;;Makhija Sangeet;;Stahr Natalie;;Sandey Maninder;;Suryawanshi Amol;;Saxena Ankit;;Dagur Pradeep K;;McCoy J Philip;;Levine Stewart J;;Mishra Amarjit.Frontiers in immunology.2020
[5]成雅.活血胶囊通过p38激活ADAM17调控血小板膜受体的实验研究[D].陕西中医药大学,2021.