背景[1-3]
口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)适用于检测口蹄疫病毒A型(FMDV-A)的RNA，用于口蹄疫病毒A型(FMDV-A)感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。产品不提供活体样品做阳性对照，仅提供人工合成的特异性RNA片段标准品作为阳性对照，仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗用途。
A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVV）是一种猪新发病毒,主要在育肥猪和母猪引发严重的水疱性疾病,新生仔猪死亡率高达100%,主要症状表现为厌食、嗜睡、发热以及皮肤和鼻镜部位的水疱病变。同属于微小RNA病毒科的猪捷申病毒（Porcine Teschovirus,PTV）和口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）同样是猪新发和再发传染病的主要病原体。这三种病毒性疾病难以通过临床表现进行区分。因此,准确和快速的诊断对实施有效的防控策略至关重要。
蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)
检验原理
口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)针对口蹄疫病毒A型的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含口蹄疫病毒A型基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
产品特点
特异性好：采用TaqMan荧光探针法进行扩增。
灵敏度高：检测灵敏度可达500copies/uL以下。
操作简便：采用一步法荧光定量RT-PCR进行扩增，逆转录步骤与PCR扩增在一管反应液中完成。
适用仪器
ABI、安捷伦、Roche、博日，天隆，宏石，鲲鹏等荧光定量PCR仪。
自备：无DNA/RNA酶的1.5mL离心管，0.2mL PCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。
操作步骤
1.样品处理（样本处理区）
1.1.样本前处理
1.2.DNA提取
2.试剂配制（试剂准备区）
3.加样（样本处理区）
4.PCR扩增（核酸扩增区）
5.结果分析判定
6.质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；以上条件应同时满足，否则实验视为无效。7.产品性能指标阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。最低检测限：检测灵敏度可达500copies/uL以下。精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于3%。
应用[4][5]
口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)可以用于A型塞内卡病毒核酸检测方法的建立及其VP1蛋白单克隆抗体制备
建立了一种能同时检测SVV、FMDV和PTV的三重Taqman荧光定量PCR方法,并且制备了针对SVV VP1蛋白的单克隆抗体,为临床上SVV的防控提供了重要支撑。1.SVV、FMDV及PTV慢病毒标准品的构建为了更好模拟病毒本身特点,确保荧光定量PCR技术在病毒定量检测中的准确性,采用基于慢病毒体系构建的荧光定量PCR标准品能有效提高检测的可靠性。
本研究利用“三质粒包装”系统,构建了包含SVV VP1、FMDV VP1和PTV 5’UTR基因保守序列的复制缺陷型慢病毒颗粒,利用嘌呤霉素最小致死量对所包装的完整慢病毒颗粒进行滴度测定,所测得SVV、FMDV和PTV慢病毒滴度分别为:2×10～7 TU/m L、2×10～8 TU/m L和2×10～6 TU/m L。2.SVV、FMDV及PTV三重Taqman荧光定量检测方法的建立为实现SVV、FMDV和PTV三种病原核酸的同时检测,本研究针对SVV VP1、FMDV VP1和PTV 5’UTR保守区域设计了引物和探针,通过扩增体系优化、特异性、灵敏性、重复性等试验,以重组阳性质粒和慢病毒cDNA为标准品分别建立了标准曲线。重组阳性质粒标准品所建标准曲线分别为:SVV:Y=-3.521×X+12.31,R2=0.997;FMDV:Y=-3.399×X+13.75,R2=0.998;PTV:Y=-3.264×X+14.75,R2=0.997。慢病毒标准品所建标准曲线分别为:SVV:Y=-3.144×X+20.05,R2=0.996;FMDV:Y=-3.536×X+16.30,R2=0.995;PTV:Y=-3.133×X+18.56,R2=0.991。标准曲线表明重组阳性质粒拷贝数和各病毒粒子数与其Ct值之间呈良好线性关系。对比商品化的口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)等试剂盒本方法特异性检测验证该方法能够特异地检测SVV、FMDV和PTV三种病毒,对猪流行性腹泻病毒、猪圆病毒环2型、猪流感病毒、经典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪德尔塔冠状病毒、博卡病毒、诺如病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌及格拉瑟氏菌等多种病原均无交叉反应。灵敏度试验结果表明SVV、FMDV和PTV的最低检测浓度均可达到1×10～1/μL;重复性试验结果表明组间和组内变异系数均小于5%。利用构建好的三重TaqMan荧光定量PCR开展临床样本检测,对浙江省内部分地区送检仔猪或死亡仔猪的肛拭子、肺脏、脾脏等共126份样品进行检测,均未检测出三种病毒。
参考文献
[1]Expression of VP1 protein of foot-and-mouth disease virus serotype O originated from Indonesia in mammalian cells as potential immunogen[J].T Widayanti;J Suryanggono;S Pambudi;R Maryam.IOP Conference Series:Earth and Environmental Science.2023
[2]Experimental infection of foot and mouth disease virus(FMDV)upregulates the expression of coxsackie and adenovirus receptor(CAR)in the myocardium of suckling mice.[J].Priyanka Mahadappa;Ranjitha H B;Karikalan M;Chandramohan S;Behera Subhasmitha;Gnanavel V;Tamilselvum R P;Umapathi V;Dechamma H J;Krishnaswamy Narayanan.Microbial pathogenesis.2023
[3]Cells at early and late stages of infection with Senecavirus A:Comparative analysis of N6-methyladenosine modification on mRNAs.[J].Meng Hailan;Li Ziwei;Wang Ling;Lyu Liangpeng;Liu Shuqing;Wei Rong;Ni Bo;Liu Fuxiao.Virology.2023
[4]Structural and nonstructural proteins of Senecavirus A:Recent research advances,and lessons learned from those of other picornaviruses.[J].Wang Qianqian;Meng Hailan;Ge Dong;Shan Hu;Geri Letu;Liu Fuxiao.Virology.2023
[5]甘诗琪.A型塞内卡病毒核酸检测方法的建立及其VP1蛋白单克隆抗体制备[D].浙江农林大学,2024.