伊文思蓝，英文名称Evans blue，是一种常用的偶氮染料制剂，与血浆白蛋白有很高的亲和力，可用来标记白蛋白。作为一种染料，伊文思蓝可降低由于标记物造成的荧光干扰，或降低细胞或组织本身的某些结构产生的自荧光。
染色原理
伊文思蓝在生理状态下，血浆白蛋白无法透过血脑屏障，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。当神经系统血脑屏障被破坏时，伊文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。伊文思蓝染料在荧光波长 470 与 540 nm 各有一强峰，其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。
伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中伊文思蓝染料荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的伊文思蓝染料含量进行定量分析。
实验步骤
伊文思蓝检测血脑屏障通透性
步骤如下：
配制 2% 的伊文思蓝染液（2 g + 100 mL 双蒸水）、含有 20 U/mL 肝素的氯化钠溶液备用。
用麻醉剂麻醉小鼠（这里麻醉剂不做推荐，根据小鼠体重选择合适的剂量）。
从尾静脉或股静脉注射 2% 的伊文思蓝染液（2 mL/kg）。
打开小鼠胸腔，从心尖部缓慢注入 0.9 氯化钠溶液（含肝素），剪开右心房，直到右心房中流出的液体澄清，停止灌注。
分离脑组织，若有明显着色，可直接用体式显微镜进行拍照
进行大体拍照后，可根据情况和需求将脑组织进行切割，用于制备冰 冻切片进行共聚焦拍照，或匀浆后取上清在 620 nm 处进行分光光度计测量。
伊文思蓝检测内皮细胞屏障通透性
步骤如下：
（1）单层细胞屏障建立
细胞消化、计数并调整细胞浓度至 1×105 细胞/mL，移液器取 1 mL 细胞悬液接种于孔径为 3 μm 的 Transwell 小室中，并将小室插入 24 孔细胞培养板，培养板下室提前加入 1 mL 完全细胞培养基，置于 37 ℃，5% CO2 细胞培养箱中，每两天使用细胞电阻仪测量一次跨膜电阻（TEER）并记录数值，至 TEER 稳定且持续时，认为单层细胞屏障形成；
（2）伊文思蓝-血清白蛋白（EB-BSA）工作液配制
2% EB 贮存液与 60 倍体积的 4% BSA 混合，用 PBS 稀释至终浓度为 0.67 mg/mL；
（3）伊文思蓝渗漏测定
取出 Transwell 小室，PBS 洗 2 次后，放入新的 24 孔板，下室加入 600 μL 4% BSA 溶液，上室加入 100 μL EB-BSA 工作液，以保证上室与下室液面高度一致，消除液面高度差引起的液体渗漏，于 37 ℃，5% CO2 细胞培养箱中平衡 1 h；
（4）渗透性评估
① 取出 Transwell 小室，吸取下室液体于 1.5 mL EP 管中，1 000 rpm 离心 5 min，取 200 μL 加入 96 孔板；
② 另将 EB-BSA 工作液（初始浓度为 0.67 mg/mL）倍比稀释，分别取 200 μL 加入 96 孔板，使用多功能酶标仪在 620 nm 波长下测量 OD 值并制作标准曲线；
③ 根据标准曲线计算 Transwell 下室液体中 EB 浓度，该浓度代表由上室渗漏至下室的伊文思蓝的含量，即单层内皮细胞的通透性。
注意事项
伊文思蓝染液最好提前计算好用量，现配现用。
统计分析时，分光光度计所测数值为吸光度，若想进一步定量需要提前制备标准品，构建标准曲线进行定量分析。
共聚焦拍摄的荧光图片可通过 imageJ 进行相对定量分析。