背景技术
卡格列肽(Cagrilintide)是一种新型长效酰化胰淀素类似物,作为非选择性胰淀素受体(AMYR)和降钙素G蛋白偶联受体(CTR)激动剂,是由38个氨基酸组成的环状多肽,序列中含有38个氨基酸,并且含有一对二硫键。.卡格列肽可显著减轻体重,减少食物摄入,在肥胖研究中具有潜力。胰淀素(amylin)是GLP-1信号通路以外,另一种与饥饿和饱腹感相关的激素。
卡格列肽能够减少能量摄入,调节食物选择和偏好,其与胰岛素共同分泌而发挥葡萄糖调节作用,抑制餐后胰高血糖素释放,并延迟胃排空。在治疗糖尿病,肥胖症,代谢综合症以及心血管疾病等方面具有明显的优势,需求应用前景广泛。
目前合成卡格列肽的主要方法为专利CN202111615700.8中所公开的方法，采用选取卡格列肽序列的第7-8位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Ala-Thr(pro-me-me)-OH,序列的第10-11位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Ala-Thr(pro-me-me)-OH,序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Ser-Ser(pro-me-me)-OH;其余位点按照氨基酸序列进行偶联反应;肽树脂经裂解得到卡格列肽线性肽;再经过液相环化得到卡格列肽粗品，经纯化制备、转盐、浓缩、冻干得到卡格列肽精肽。该方法使用了三个伪辅二肽进行偶联,虽然解决了因树脂缩聚而导致的偶联难度增大的问题,但增加了生产成本,且该工艺制备所得精肽纯度较低,未达到原料药的质量要求。
制备方法[1]
(1)卡格列肽肽树脂的制备
取1.5mmol第1个保护氨基酸和1.5mmol HOBT，用适量DMF溶解并冷却至0～15℃；另取1.5mmol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于0～15℃环境中搅拌反应10分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.5mmol的氨基树脂(取代度0.42mmol/g)，采用DMF溶液溶胀60分钟，使用20％Pip/DMF溶液去保护30min，洗涤过滤得到待反应的树脂。将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到待反应的树脂中，于25～35℃条件下偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂：Fmoc‑Pro‑Resin。采用上述同样方法，依次接入上述对应保护氨基酸：Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，Fmoc‑Asn(Trt)‑OH，Fmoc‑Ser(tBu)‑OH，Fmoc‑Gly‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Asn(Trt)‑OH，Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，Fmoc‑Pro‑OH·H2O，Fmoc‑Pro‑OH·H2O，Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑Ile‑OH，Fmoc‑Pro‑OH·H2O，Fmoc‑Phe‑OH，Fmoc‑Asn(Trt)‑OH，Fmoc‑Asn(Trt)‑OH，Fmoc‑Ser(tBu)‑OH，Fmoc‑Ser(tBu)‑OH，Fmoc‑His(Trt)‑OH，Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH，Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑Pro‑OH·H2O，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH·H2O，Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH，Fmoc‑Gln(Trt)‑OH，Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH·H2O，Fmoc‑Cys(Trt)‑OH，Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH·H2O，Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，Fmoc‑Asn(Trt)‑OH，Fmoc‑Cys(Trt)‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH，Fmoc‑Glu‑OtBu，二十烷二酸单叔丁酯，得卡格列肽肽树脂4.42g。
(2)卡格列肽线性肽粗肽的制备
取卡格列肽肽树脂2.00g，加入TFA混合溶液，混合溶液配比为TFA:EDT/Tis/苯酚/H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5，用量为8ml/克树脂；20～30℃搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后加入MTBE沉淀，再用MTBE洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为卡格列肽线性肽粗肽0.80g。
(3)卡格列肽环肽粗肽溶液的制备
取卡格列肽线性肽粗肽0.50g，按浓度5.0mg/ml配置成线性肽粗肽溶液，在搅拌状态下滴加碘甲醇溶液至溶液显棕色，再滴加维生素C溶液至溶液无色透明，得到卡格列肽环肽粗肽溶液。
(4)卡格列肽精肽的制备
取卡格列肽环肽粗肽溶液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤；采用高效液相色谱法进行纯化制备，收集卡格列肽馏分；采用高效液相色谱法进行换盐，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到卡格列肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得卡格列肽精肽12.2mg，纯度为99.51％，最大单一杂质0.34％，总收率为1.96％，分子量为4409.5。
参考文献
[1] 杭州思诺达医药科技有限责任公司. 一种卡格列肽的合成方法:CN202311853782.9[P]. 2024-05-07.