琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳,是以琼脂糖为介质,对不同大小的DNA或RNA实现分离的一种电泳方法。琼脂糖是一种多糖,具有亲水性,但是不带电荷。使得DNA在碱性条件下使其带负电荷(pH8.0的缓冲液),在电流作用下,以琼脂糖凝胶为介质,由负极向正极移动,根据不同的DNA分子片段的大小和形状不同,在电场中泳动的速率也不相同,同时在样品中加入染料(如EB或花青素关染料)能够和DNA分子间形成络合物,经过紫外照射,可以看到DNA的位置(比对marker可知分子量大小),从而达到分离、鉴定的目的。如图1为琼脂糖凝胶电泳原理。
操作步骤
步骤如下:
1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml): 称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1。0%琼脂糖凝胶液。
2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子。将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
3.加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序)。
4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。
5.电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min。
6.观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。