背景技术
蛋氨酸，又名甲硫氨酸、2‑氨基‑4‑甲硫基‑丁酸，是一种必需氨基酸，对于人体的生长发育和健康具有重要作用，被广泛用于医药、食品和化妆品等多个行业。同时，蛋氨酸也是动物饲料里必不可少的添加剂，可用来提高家禽的瘦肉量与缩短饲养周期。目前用于饲料的市售蛋氨酸主要分为蛋氨酸与羟基蛋氨酸(又称为“2‑羟基‑4‑甲硫基‑丁酸”、“液体蛋氨酸”)，两者在生物体内具有同样的生理功能。近年来全球范围内对蛋氨酸的需求量逐年增长，而我国的蛋氨酸产量无法满足饲料行业快速发展的需求，因此主要依赖于从海外进口。
目前，2-羟基-4-甲硫基-丁酸(羟基蛋氨酸)的生产方法主要是化学合成法与发酵法，由于发酵法产量较低，因此全球的2-羟基-4-甲硫基-丁酸生产厂家普遍采用化学合成法。化学合成法又可分为海因法与氰醇法，其中海因法可用来合成蛋氨酸，工艺技术较为成熟，但生产过程会存在大量硫酸钠等副产物，且技术与设备复杂、能耗大；氰醇法工艺路线短，但生产过程中同样存在氰化氢等剧毒物质，对设备安全性要求高，以及产生三废问题。
因此，寻求一条绿色高效，降低生产成本且易于工业化生产2-羟基-4-甲硫基-丁酸的方法显得格外重要。
合成方法[1]
1、α‑羟基酸脱氢酶重组质粒的构建
根据先前报道，L‑乳酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶通常底物特异高，仅对天然底物具有高活性。来自大肠杆菌(E.coli)的苹果酸脱氢酶突变体(EcMdH‑5E)对4‑羟基‑2‑氧代丁酸具有较高活性，且结构与α‑酮‑ γ‑甲硫基丁酸类似。因此，根据苹果酸脱氢酶(NCBI登录号：VZT40586，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)与EcMdH‑5E的序列比对结果，在对应位点引入5个突变位点(I12V、R81A、M85E、G179D和D86S)，并对得到的PaMDH‑5E(氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)进行密码子优化与基因合成。 为减少昂贵的NADH辅酶的使用，引入甲酸脱氢酶PsFDH(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)以实现NADH的再生。
将编码苹果酸脱氢酶PaMDH‑5E的基因插入到质粒pCDFDuet的第二个多酶切位点上，将编码甲酸脱氢酶PsFDH的基因插入到质粒pCDFDuet的第一个多酶切位点上，获得重组质粒pCDFDuet‑P1‑PsFDH‑P2‑PaMDH‑5E。
2、α‑羟基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的诱导培养
将上述获得的重组质粒pCDFDuet‑P1‑PsFDH‑P2‑PaMDH‑5E转化到大肠杆 菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆接种到1‑5mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm培养过夜。再按1％的接种量转接到含50μL/mL链霉素的100mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6‑0.8时，加入终浓度为0.1‑0.5mM的IPTG，于25℃、180rpm培养18‑24h，8000rpm离心5min收集菌体，生理盐水洗涤两次，离心收集菌体备用。
3、全细胞转化α‑酮‑γ‑甲硫基丁酸合成2-羟基-4-甲硫基-丁酸
将步骤2中获得的菌体用0.1M KH2PO4‑K2HPO4 pH7.0重悬，使菌体的浓度为40克湿细胞/升，加入α‑酮‑γ‑甲硫基丁酸使其在反应体系的浓度为0.1M，同时加入120mM甲酸铵与0.2mM NAD+，于pH7、37℃条件下，转速200rpm转化12h。
4、样品检测与结果
将步骤3中获得的反应样品稀释，离心后取上清用0.22μM滤膜过滤，将样品进行液相色谱检测产物2-羟基-4-甲硫基-丁酸的生成。液相条件：色谱柱为Coregel 107H column(4.6×250mm)，流动相为含10mM的硫酸溶液，采用等度洗脱(流速为0.5mL/min)，检测波长为UV 214nm。 液相结果显示，底物2-羟基-4-甲硫基-丁酸的转化率达到99％以上。
参考文献
[1] 摩珈(上海)生物科技有限公司. 2-氨基-4-甲硫基-丁酸或2-羟基-4-甲硫基-丁酸的制备方法:CN202410317376.9[P]. 2025-09-19.