背景[1-6]
Thermo Scientific PageBlue Protein Staining Solution是一种灵敏，经济的胶体考马斯G-250染料配方，用于聚丙烯酰胺凝胶和不含甲醇或乙酸的PVDF膜上蛋白质的终点染色。
简单的PageBlue蛋白质染色溶液方案灵敏，高效，即使在过夜染色后也消除了过度染色凝胶的担忧。这种蛋白质染色剂的动态范围为5至500ng，比传统的考马斯R-250染料灵敏度高约10倍。此外，PageBlue蛋白质染色解决方案是经济的，因为它可以重复使用多达三次而不会有任何灵敏度损失。
特点[3-6]
PageBlue蛋白染色液的特点：
•易于使用-只需将凝胶浸泡在即用型溶液中，观察染色条带，不会脱色
•快速25至40分钟方案
•安全-不含甲醇或乙酸
•动态范围-线性动态范围5至500ng
•经济-可重复使用3次
简单的PageBlue蛋白质染色溶液方案灵敏，高效，即使在过夜染色后也消除了过度染色凝胶的担忧。这种蛋白质染色剂的动态范围为5至500ng，比传统的考马斯R-250染料灵敏度高约10倍。此外，PageBlue蛋白质染色解决方案是经济的，因为它可以重复使用多达三次而不会有任何灵敏度损失。
应用[7][8]
用于可视化和量化在1D，2D和IEF聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF膜上后的染色。
在线粒体融合参与营养缺乏环境肝癌细胞糖代谢重编程调控的作用与机制研究中利用qrt-pcr与westernblot实验,检测营养缺乏环境下参与线粒体分裂/融合调控的关键分子及其上游信号分子的表达与活性,分析营养缺乏环境促进线粒体融合的分子机制。利用qrt-pcr、westernblot与gc-ms(气相色谱-质谱联用)技术,分析营养缺乏时线粒体融合对肝癌细胞糖酵解与氧化磷酸的调控。线粒体是调控细胞代谢最重要的细胞器,通过不断地分裂/融合调控自身功能并对外界刺激做出适应性反应。
利用tem(透射电镜)、bluenative-page、co-ip、qrt-pcr与westernblot技术,对营养缺乏时线粒体融合调控氧化磷酸化与糖酵解的机制进行研究。5.利用fcm(流式细胞术)与克隆形成实验,分析营养缺乏时线粒体融合对肝癌细胞存活的影响。大量研究证实,线粒体分裂/融合异常与多种神经退行性疾病、心血管疾病及代谢性疾病的发生进展密切相关。近年来研究证实,多种类型肿瘤中线粒体分裂/融合发生异常,并参与肿瘤恶性进展。实体瘤常由于生长过快而导致内部出现慢性营养缺乏微环境,肿瘤细胞需感知并通过代谢重编程做出适应才能继续生存,而目前肿瘤适应营养缺乏的机制仍不十分清楚,阐明其机制对肿瘤防治具有重大意义。
我们前期研究发现,营养缺乏环境时肝癌细胞线粒融合变长。作为细胞能量代谢调控核心的线粒体,其形态结构的变化是否参与肝癌细胞在营养缺乏时的代谢适应尚不清楚。
结果:
1.mito-tracker荧光染色证实营养缺乏促进肝癌细胞线粒体融合变长;透射电镜(tem)对肝癌组织线粒体形态观察发现,肿瘤中心区(营养缺乏)较边缘区(营养充足)线粒体变长。
2.营养缺乏时,线粒体分裂/融合调控关键分子drp1、fis1、mfn1、mfn2与opa1表达均未发生显著变化,而线粒体定位的drp1因被pka磷酸化(s637)而减少,导致线粒体变长。
3.营养缺乏时,线粒体融合促进肝癌细胞氧化磷酸而抑制糖酵解。
4.营养缺乏时,线粒体融合通过使线粒体嵴紧密促进氧化呼吸链复合体组装,从而激活氧化磷酸化而抑制糖酵解;线粒体融合通过氧化磷酸化介导的nad+/sirt1/hif-1α信号抑制糖酵解。
5.线粒体融合抑制肝癌细胞在营养缺乏环境下的凋亡,促进肝癌细胞克隆形成能力。
6.营养缺乏诱导的线粒体融合促进肿瘤生长。
7.介导营养缺乏环境下线粒体融合的关键分子p-drp1s937表达水平与肝癌患者肿瘤分级、tnm分期及血清afp水平正相关,与患者预后显著负相关性。
参考文献
[1]Mitochondria and Cancer[J].Wei-Xing Zong,Joshua D.Rabinowitz,Eileen White.Molecular Cell.2016(5)
[2]Downregulation of fatty acid synthase complex suppresses cell migrationby targeting phospho?AKT in bladder cancer[J].Shuai?Shuai Zheng,Jian?Gang Gao,Zhi?Jun Liu,Xin?Hong Zhang,Shuai Wu,Bo?Wen Weng,You?Lin Wang,Si?Chuan Hou,Bo Jiang.Molecular Medicine Reports.2016(2)
[3]Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation[J].Timothy Wai,Thomas Langer.Trends in Endocrinology&Metabolism.2016(2)
[4]Mitochondrial dynamics,mitophagy and cardiovascular disease[J].César Vásquez‐Trincado,Ivonne García‐Carvajal,Christian Pennanen,Valentina Parra,Joseph A.Hill,Beverly A.Rothermel,Sergio Lavandero.J Physiol.2016(3)
[5]Key Roles of Glutamine Pathways in Reprogramming the Cancer Metabolism[J].Krzysztof Piotr Michalak,Agnieszka Ma?kowska-K?dziora,Bogus?aw Sobolewski,Piotr Wo?niak,Claudio Cabello-Verrugio.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2015
[6]Mitochondrial dynamics and quality control in Huntington’s disease[J].Pedro Guedes-Dias,Brígida R.Pinho,Tania R.Soares,Jo?o de Proen?a,Michael R.Duchen,Jorge M.A.Oliveira.Neurobiology of Disease.2015
[7]ATP Citrate Lyase(ACLY):A Promising Target for Cancer Prevention and Treatment[J].Amrita Devi Khwairakpam,Mayengbam Singh Shyamananda,Bethsebie Lalduhsaki Sailo,Sivakumar Raju Rathnakaram,Ganesan Padmavathi,Jibon Kotoky,Ajaikumar B.Kunnumakkara.Current Drug Targets.2015(2)
[8]李积彬.线粒体融合参与营养缺乏环境肝癌细胞糖代谢重编程调控的作用与机制研究[D].第四军医大学,2016.