琥乙红霉素(Erythromycin Ethylsuccinate,EES)属大环内酯类抗生素,是红霉素(Erythromycin,EM)的衍生物，化学式为C43H75NO16,分子量为862.07。其具有抗菌谱广,口服吸收好。〈中国药典》(2010版)采用抗生素微生物检定法测其含量。该法虽能真实地测得抗菌活性的效价,结果基本可靠,但由于琥乙红霉素的主要降解产物红霉素也有生物活性,故抗生素微生物测定法专属性不强,且操作繁琐,检验周期长,不适合对产品的快速质量控制。因此随着这类药物在临床上广泛应用,关于其含量测定的方法的报道也在不断增多,本文将近年来关于琥乙红霉素含量测定的方法综述如下。
测定研究[1]
1、高效液相色谱法
王爱华等人建立琥乙红霉素人体内活性代谢物红霉素的HPLC-MS/MS分析方法测定虢乙红霉素颗粒体内活性代谢物。选用克拉霉素为内标,血浆样品经正己烷-二氯甲烷-异丙醇(300:150:15)提取处理,通过检测活性代谢物红霉素的浓度来监测琥乙红霉素体内行为,色谱条件:Waters C18色谱柱(4.6mmx250mm,5um),甲醇-水(80:20,含0.5%甲酸)为流动相,流速0.6mL・min-1,采用HPLC-MS/MS检测系统(SRM模式),质谱采用电喷雾电离源(ESI),红霉素选择检测离子对为m/z734→m/z158,内标克拉霉素选择检测离子对为m/z748-m/z158得到结果为血浆中红霉素检测方法的线性范围为9.724~2431.0ng・mL-1,最低检测限可达9.724ng・ml-1。血浆中红霉素的平均回收率为77.6%~80.0%;日内、日间RSD均小于11%。方法灵敏、准确、选择性高,可用于监测琥乙红霉素的体内行为。类似的,Gu Y等通过高效液相色谱-电喷雾申联质谱法(LC-ESI-MS/MS)测定人体血浆中琥乙红霉素及其体内活性代谢物。
2、分光光度法
2.1酸性染料比色法
安彩贤等根据琥乙红霉素的水解产物红霉素与甲基橙形成离子对在氯仿中呈金黄色,且最大吸收波长在420nm的特点，采用酸性染料比色法测定了琥乙红霉素及其片剂的含量。平均回收率分别为99.4%(RSD = 0.636%,n=2),99.5%(RSD=0.283%,n=2)。用该方法法测定利菌沙片中琥乙红霉素含量，所得结果与抗生素微生物检定接近。
2.2紫外分光光度法
〈中国药典》(2010年版)二部规定其溶出度方法中有紫外-可见分光光度法,王晓玲等根据琥乙红霉素在酸性条件下水解后的显色产物在482nm处有最大吸收的特点，利用紫外分光光度法测定琥乙红霉素胶囊剂中其有效主成分含量,并做了辅料的干扰实验,确定了辅料在482nm波长处不会干扰琥乙红霉素制剂的含量测定。琥乙红霉素浓度在16.65-49.68ug/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系。该法平均回收率为99.3%(RSD =0.7%,n=5);最后将样品含量测定结果与抗生素微生物检定法进行比较,，经t检验，无显著差异(P>0.05)。
2.3荷移反应光度法
红霉素琥珀酸乙酯与茜素磺酸钠,氯冉酸,百里酚蓝,醌茜素,水杨基荧光酮,紫色素,茜素红龙胆紫等均易发生荷移反应。李华佩等利用琥乙红霉素与茜素磺酸钠在乙醇-水介质中发生电荷转移反应,建立了一种简单、快速的荷移分光光度法测定琥乙红霉素的含量，并探讨了该反应的机理及荷移络合物的组成等。实验得出琥乙红霉素浓度在10~100mg・mL-1范围内服从比耳定律，多次测量其回收率均大于98%。李华侃和其他人用此法测琥乙红霉素的含量得到的结果与药典方法进行比较，结果也基本吻合。
3、电化学法
3.1电位分析法
姚秉华等以PVC为支持载体,四苯硼钠-EES为电活性物质研制了性能良好的琥乙红霉素PVC膜离子选择性电极。并利用该电极测定利君沙有效成分,并将测定结果与电位滴定法、抗生素微生物检定法比较基本吻合。该电极制作方法简便,响应快,选择性和稳定性较好,可用于琥乙红霉素的快速测定。任艳艳等以碳糊电极为工作电极,采用循环伏安法和示差脉冲伏安法研究了琥乙红霉素在电极上的电化学行为,建立了一种测定EES的电化学新方法,该法具有较高的选择性和灵敏度,可用于药剂中EES含量的测定。
3.2流动注射化学发光法
王建国,汪敬武研究发现碱性条件下,琥乙红霉素对鲁米诺-铁氰化钾化学发光作用有抑制作用,且其抑制作用与琥乙红霉素浓度在一定范围内成正比。从而结合流动注射技术建立了测定虢乙红霉索的方法,同时讨论了有关物质对该法的干扰。利用该法得到光强差和琥乙红霉索浓度作工作曲线,琥乙红霉索测定线性范围为0.5-125mg・L-1,计算出检出限为0.16mg・L-1,平均回收率为99.3%(RSD=1.8%,n=3)。用该法测定琥乙红毎素片剂的含量,并与色谱法对照,结果基本吻合。
4、差示旋光测定法
胡德放等建立差示旋光测定法通过测定差示旋光度差来测定琥乙红霉素的含量。该法操作简便、快速、准确、重现性好,平均回收率为99.7%(RSD=0.6%,n=4)用该法测定琥乙红霉素片的含量,并做了赋形剂的干扰实验,排除了其对测定结果的影响,测定结果与抗生素微生物检定法比较，结果满意。此法准确、可靠,适合于对琥乙红霉紊含量的快速分析。
5、比浊法
魏立平,张润婕建立浊度法测定虢乙红霉素片效价的方法。利用标准曲线法,以金黄色葡萄球菌为实验菌,加菌量0.3%(V/V),37℃培养3~4h测定,得标准品溶液浓度的对数值和吸光度值的标准曲线,按标准曲线法计算供试品的效价值。所得结果表明抗生素浓度在0.40~0.97ug・mL-1的范围内成良好的线性关系,标准曲线法测定琥乙红霉素片效价的平均回收率为99.9%,RSD=1.4%(n=9)。浊度法灵敏、快速,可作为测定琥乙红霉素片效价的方法。将比浊法与管碟法测定结果做比较,发现两种方法测得的效价结果基本一致,但比浊法的可信限率明显低于管碟法。
参考文献
[1] 谢梦,叶莉,陈莲惠. 琥乙红霉素测定方法研究进展[J]. 山东化工,2014,43(6):54-57. DOI:10.3969/j.issn.1008-021X.2014.06.019.