介绍
2-羟甲基-1,3-丙二醇又称三羟甲基乙烷（Trimethylol ethane，TME），分子式为 C₄H₁₀O₃，分子量 106.12，CAS号为 77-85-0，是一种白色结晶状的新戊烷结构三元伯醇，具有三个对称、反应活性相近的羟甲基，与季戊四醇性质相近。它吸湿性低、热稳定性好，主要用作合成聚酯、醇酸树脂、聚氨酯、增塑剂和润滑油的多元醇单体。
图一 2-羟甲基-1,3-丙二醇
催化合成(R)-β-羟基异丁酸
用于催化2-羟甲基-1,3-丙二醇的菌体培养：发酵培养基配方:山梨醇73.0 g/L,酵母粉18.4 g/L,(NH4)2SO41.5 g/L,KH2PO41.52 g/L,MgSO4·7H2O 0.47 g/L。接种后置于摇床内在28℃,250 r/min下恒温振荡培养。在3.7L发酵罐中配制2 L培养基。发酵期间主要控制参数如下:(1)溶氧。通气量控制在300 L/h,发酵罐罐压控制在0.3～0.6×105Pa,最低搅拌转速控制在400 r/min,当发酵罐溶氧降至30%以下时,提高转速以增加溶氧,最高转速为1 000 r/min。(2)pH值。自动流加2 mol/L的NaOH溶液,保持pH值在6.0左右。(3)温度。培养过程中温度保持在28℃。
2-甲基-1,3-丙二醇转化反应
用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液配成一定菌体浓度的菌悬液,加入一定量的底物2-甲基-1,3-丙二醇,反应体系为10 mL,置于50 mL的三角烧瓶中,于28℃、250 r/min下反应。摇瓶转化实验均做3个平行样,取实验数据平均值。通过调节转速、罐压和通气速率来控制溶氧在30%以上。间隔0.5～1 h取样用气相色谱分析底物浓度,随时调整底物流加速度,使反应器内的底物浓度控制在5 g/L左右。转化液经离心除去菌体,真空旋转蒸发浓缩。经半制备色谱分离纯化得到目标产物。
2-甲基-1,3-丙二醇测定方法的确定
确定2-甲基-1,3-丙二醇的具体色谱条件为:气相色谱(Agilent 6890),DB-WAX毛细管柱,进样口温度为250℃,检测器的温度为280℃。升温程序为:100℃保持2 min,然后以20℃/min升温至180℃,保持1 min,再以30℃/min升温至220℃,保持5 min。(R,S)-β-羟基异丁酸甲酯标品用HP-chiral 20B手性柱在Agilent 6890气相色谱仪上进行分析。样品预处理:1 mL转化液加入2 mL甲醇(含3%H2SO4),在密闭的条件下于80℃反应3 h,生成甲酯后加入2 mL CHCl3萃取,然后用气相色谱进行分析。
在3.7 L生物反应器中转化2-甲基-1,3-丙二醇
采用上述最适条件,在3.7 L反应器中进行氧化葡萄糖酸杆菌细胞转化2-甲基-1,3-丙二醇的反应。为了消除底物对细胞活性的抑制,采取流加策略维持反应体系中的底物浓度不超过5 g/L,结果如图二所示。在反应开始后10 h内,反应非常迅速。随着反应的进行,产物积累到30 g/L时,产物抑制效应逐渐显现,反应速率下降。当反应进行到2 4 h时,(R)-β-羟基异丁酸的浓度达到50.2 g/L,转化率和光学纯度分别达到90.5%和93.2%。相比于摇瓶中的转化结果,发酵罐中的转化率和积累的(R)-β-羟基异丁酸浓度都有明显的提高。同时对副产物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的浓度进行了测定,发现它们都是很微量的,浓度都小于1 g/L[1]。
图二 在3.7 L发酵罐中补料分批转化2-甲 基-1,3-丙二醇生成(R)-β-羟基异丁酸
参考文献
[1]魏国栋,魏东芝,林金萍.氧化葡萄糖酸杆菌立体选择催化2-甲基-1,3-丙二醇合成(R)-β-羟基异丁酸[J].食品与发酵工业,2010,36(8):12-16.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2010.08.004