近年来,柱前衍生化RP-HPLC法测定氨基酸的技术取得了很大的进展并有逐渐取代传统氨基酸分析仪的趋势,因为二硝基氟苯(DNFB)衍生法步骤简单,反应速度快,剩余试剂不干扰测定,因此在柱前衍生化试剂中应用较为广泛。氨肽素原地方标准的测定方法都用定氮法测定其含量,不能准确反应一个产品质量情况,而采用测定氨基酸组成的方法,能相对地控制该产品工艺。本文采用高效液相色谱法,以2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,测定了氨肽素的氨基酸组成及含量。
测定与结果
试药：14种氨基酸对照品(中国药品生物制品检定所，总氨基酸量为0.5 g·L-1,氨肽素供试品(丹东生物化学制药厂、丹东通江制药厂、锦州生物化学制药厂),2,4-二硝基氟苯衍生化试剂(取100mg2,4-二硝基氟苯,加入10mL乙腈,使其完全溶解)。
样品处理：氨肽素的水解:精密称取氨肽素100mg,置25mL发酵罐中,加6mol·L-1盐酸溶液15mL,充N2,于110℃水解12h,取出放冷,用50mL水分次洗涤,洗液并入蒸发皿中,蒸干,残渣再用盐酸溶液(0.02 mol·L-1)分次洗涤,合并洗液，滤过至100mL量瓶中，加水稀释至刻度,摇匀。
衍生化及色谱分析：取样品(对照品)1.0 mL,置10 mL量瓶中，加0.5 mol・L-1碳酸氢钠溶液0.5mL, 2,4-二硝基氟苯衍生试剂0.5mL,60°C恒温1h,取出放冷,用磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠溶液调节pH7.00)稀释至刻度。取0.1mL注入高效液相色谱仪进行分析，以保留时间定性,峰面积按外标法定量。
线性关系考察：精密量取氨基酸对照品溶液1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mL进行2,4-二硝基氟苯衍生化，结果表明，14种氨基酸在0.15~0.75g·L-1内呈良好的线性关系[1]。
结论
由于氨肽素对于血液病的作用机理尚未十分明确，还有待更进一步的探讨和研究。为了更有效地控制好该品种的质量,确保其临床疗效,本文用二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化RP-HPLC法测定其氨基酸的含量。通过酸水解使其转化成游离氨基酸,比原有地方标准测其氨基氮、总氮量的方法更确切、全面,对控制其工艺稳定性提供了可靠依据。此法具有分析时间短、成本低、重现性好、稳定性好等优点。对控制该药品质量起到一定的作用[1]。
参考文献
[1]王棘,战祥友,滕艳坤,等. DNFB柱前衍生化RP-HPLC法测定氨肽素的氨基酸含量[J]. 沈阳药科大学学报,2003,20(6):428-430. DOI:10.3969/j.issn.1006-2858.2003.06.012.