背景及概述[1]
睾酮是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量；但绝经后妇女，卵巢分泌睾酮显著减少。在男性中，它对外生殖器和第二性征的发育起着重要作用，其生物化学过程尚未完全阐明。女性中，其主要作用是作为一种雌激素的前体。同时，睾酮可能影响许多身体系统和功能，包括：血生成，体内钙平衡，骨矿化作用，脂代谢，糖代谢和前列腺增长。
大多数睾酮与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，在男性中也被称为睾丸激素结合球蛋白；少数与白蛋白结合，一小部分以游离形式存在。游离睾酮被认为是生物活性成分。然而，睾酮与白蛋白结合较弱，所以所有非SHBG结合的睾酮被认为是生物可利用的。
在儿童期，过多睾酮会诱发男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，过量的睾酮会造成不同程度的男性化，包括多毛，痤疮，月经稀发，或不育。睾酮轻度至中度升高对男性通常无明显症状，但对女性造成严重的影响。对于睾酮轻度至中度升高的确切原因往往不清楚。明显升高的常见原因包括遗传疾病(如先天性肾上腺皮质增生症)，肾上腺，睾丸和卵巢的肿瘤和运动员滥用睾丸激素或促性腺激素通。女性的睾酮降低会引起微妙的症状，这主要包括性欲下降和非特异性的情绪变化。在男性，它会导致性腺功能减退，这个特点将改变男性的第二性征和生育功能。
制备[2-3]
报道一、
步：将30g雄烯二酮溶解于10倍重量的混合溶剂中(二氯甲烷∶四氢呋喃＝1∶ 1)，冷却到-15℃。
第二步：将3g硼氢化钾溶解在30ml蒸馏水或纯水中。
第三步：用蠕动泵将第二步得到的硼氢化钾的水溶液加到步获得的、-8℃的 反应体系中，流速0.2ml/min。
第四步：加毕，在-5℃至-10℃反应至雄烯二酮反应完全(HPLC跟踪)，加入1g冰乙 酸破坏过量的硼氢化钾，旋蒸回收溶剂，加入450ml蒸馏水，冷却到10℃，过滤，水洗，真空干 燥，得粗品。
第五步：用10倍重量的无水乙醇溶解粗品，加入5wt％的活性炭脱色，趁热过滤，减 压浓缩出85wt％的乙醇，冷冻，结晶，过滤，冷冻的无水乙醇洗涤，80℃真空干燥，得白色结 晶。质量经检测，结果如下：
熔点：153-156℃(文献值：152-156℃)；含量98.5％(w/w)(HPLC法)；质谱：289[M- H]+；核磁共振1HNMR(CDCl3)0.79(s，3H，CH3)，1.12(s，3H.CH3)，3.66(t，1H)，5.72(s，H， CH)；红外谱图IR(KBr，v/cm-1)：3529，3381，3027，2943，2873，2847，1656，1610，1056。
经检测，产品是睾酮。副产3，17-二醇物含量0.45％(w/w)，睾酮收率达到了93％ (w/w)以上。
报道二、
步骤1：重组Y.lipolytica Polh菌株的构建
以实验室全合成的基因为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基 因的大量扩增。将大量扩增的17β-hsd3和gdh基因片段，纯化后分别连接到pINA1292和 pYLSC载体上，验证成功后，转化模式菌株Y.lipolytica Polh。在抗性平板上筛选阳性转化子， 接种摇瓶发酵，用HPLC检测发酵液中产物TS。检测到有产物TS，说明构建成功了具有转 化AD为TS的重组菌株。本发明最终得到具有高效转化AD为TS的Y.lipolytica Polh菌株。
步骤2：重组菌株的酶活力测定
酶活测定方法：采用HPLC方法测定。具体方法如下：取培养24h的菌液50mL,4℃， 8,000r/min离心5min收集菌体，用50mL pH 7.0的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，重悬于5ml 的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间10min。10,000r/min 离心30min获得上清液，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：酶活测定体系1mL 包括0.5mM NADPH,200μM AD(溶于甲醇)，再加入适量酶液。酶活力单位定义：37℃温 度下，1min转化1μmol AD生成TS的酶量定义为1个酶活单位(U)。葡萄糖脱氢酶活力 测定方法：1mL反应体系包括50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，10mM葡萄糖和1μM NADP+。 根据在340nm下NADPH吸光值的变化测定活力，酶活单位定义：每分钟产生1μmol NADPH 所需要的酶量。酶活分别达到7.35U/mg和4.23U/mg。
步骤3：重组菌株全细胞转化性能检测
将该菌株以5％接种量接种于100mL BMGY培养基中，培养24h，然后以5％接种量接 种于装有2L BMMY培养基的5L发酵罐中，持续添加甲醇进行诱导4天。离心回收菌体， 洗涤两次，用一定量的50mM的Tris-HCl pH 7.5缓冲液复溶,加入底物AD进行转化，转化 条件为：转化温度为37℃，转化pH为7.5，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精(摩尔比例为1:1)， 生物量为200g/L，底物浓度为5g/L。经过3次补料全细胞转化后，15g/L雄甾烯二酮转化 为14.3g/L睾酮，为国内外首次通过构建NADPH辅酶循环再生系统在毕赤酵母中利用雄甾 烯二酮转化生产睾酮，最终实现提高转化速率、高效生产睾酮的目的。
参考文献
[1][中国发明,中国发明授权]CN201410484568.5一种检测人血清中总睾酮的方法
[2] [中国发明,中国发明授权] CN201610435623.0 一种合成睾酮方法
[3] [中国发明] CN201610575007.5 一种微生物法转化雄甾烯二酮生产睾酮的方法