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黄曲霉毒素G2的检测方法

发布日期:2018/10/30 14:00:19

背景及概述[1][3]

黄曲霉毒素G2是霉菌的次生代谢物,存在于发霉的大豆、豆油、棉籽油、谷物等中。现已分离出有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2六个化合物。对多数动物具有强烈毒性,可引起某些动物肝脏致癌,其中以黄曲霉毒素B1毒性最高。它们在紫外光照射下呈强烈的荧光。

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AF)是黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)和模式曲霉(A.nomius)等在合适的温度和湿度条件下产生的真菌毒素,对人畜有强烈的致病性、致癌性,严重危害人体健康,是危害最严重的真菌毒素。污染粮食的黄曲霉毒素主要有 B1、B2、G1和G2。目前AF 的检测方法主要有薄层色谱法、胶体金试纸条法、 酶联免疫法、液相色谱法或液质联用法等方法。

检测方法[2] [3]

方法一:选择MycosepTM226 MFC 多功能柱或相当者结合高效液相色谱荧光检测器-柱后衍生测定啤酒,玉米、花生及其制品中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2,方法准确度高、灵敏度好,步骤简单,操作方便,适合在基层实验室推广。

1、方法如下:

1.1 标准液的配制

准确吸取适量的黄曲霉毒素标准储备液,用乙腈溶液稀释成混合标准工作溶液,浓度 100 ng/mL -20 ℃ 避光保存。准确吸取工作溶液 10 μL、30 μL、50 μL、 70 μL、100 μL、200 μL 在1.5 mL 样品瓶中,用乙腈—水(20+80)定容至 1.0 mL。其中黄曲霉毒素 B1、 B2、G1、G2 分别为1.0、 3.0、5.0、7.0、10.0、20.0 ng/mL。临用前配制。

1.2 样品前处理

1.2.1 啤酒样品

啤酒样品倒入烧杯中超声 10min,除去二氧化碳气体。准确称取试样 5.00 g 于50 mL 离心管中,加入乙腈—水(20+80)至 20.0 mL,涡旋 3 min,8 000 r/min 离心 5 min 取上清液备用。

1.2.2 植物油脂

准确称取样品 5.00 g 于50 mL离心管中,加入20.0 mL乙腈—水(20+80),涡旋3min,8 000 r/min 离心5 min 取上清液备用。

1.2.3 固体样品

准确称取经过磨细(粒度小于2 mm)的试样 5.00 g 于50 mL 离心管中,加入 20.0mL 乙腈—水(20+80),涡旋 3 min,8 000 r/min 离心5 min 取上清液备用。

1.3 试样净化

 移取 8.00 mL 提取液至多功能净化柱的玻璃管内,将多功能净化柱的填料管插入玻璃管内并缓慢推动填料管,净化液就被收集到净化柱的收集池内。取 5 mL 净化液在 30 ℃下用氮气缓缓吹至近干,用乙腈—水(20+80)定容至 1.00 mL,涡旋 30 s,过 0.22 μm 滤膜,收集滤液于进样瓶中,上机测定。

1.4 高效液相色谱条件

色谱柱色谱柱inertsustain C18 柱(填料直径5μm内径 4.6 mm 柱长 250 mm)柱温:40℃ 荧光检测器 激发波长:360nm发射波长:440 nm流动相:水+甲醇+乙腈:68+16+16 进样量:20 μL 流速:1.0 mL/min柱后衍生系统衍生液 0.05 %碘溶液 流速 0.5 mL/min 反应管温度:70 ℃

2、结果

2.1 四种黄曲霉毒素色谱图 由图可以看出,黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2 在 1.2.4 色谱条件下分离效果良好、没有其它干扰峰。

2.2 线性与检出限 分别吸取一定量的标准溶液,用乙腈—水(20+80)配置成一系列标准混合溶液,在0.1 ng/mL—50.0 ng/mL 之间,在1. 4 色谱条件下,以峰面积对浓度作线性回归分析。结果见表 1。根据3 倍信噪比(3S/N)结合检测方法计算出检出限。由表 1 可以看出黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 线性关系良好,检出限能够达到国家标准 GB2761-2011 《食品中真菌毒素限量》 的要求。

2.3 精密度与回收率

用本法在已知浓度的同一样品 5.00 g 中加入黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2 混标 10 ng,重复 6 次测定,计算实测含量,测定结果见表 2。由表 2 可知,黄曲霉毒素 G1、 G2、 B1、 B2 各相对标准偏差在 3.87 %~5.00 % 之间,回收率达到 85 %~94 %。说明该方法准确度较好,精密度良好,符合分析要求。

方法二:

赵群等建立了一种使用超高效液相色谱仪LC- 30A测定粮食中黄曲霉毒素的方法。 结果表明,该方法线性良好,相关系数均大于0.9999;进样量2μL,仪器检出限为0.002~0.019μg/L,仪器定量限为0.007~0.065μg/L;玉米样品加标回收率在 93.9%~104.4%。本方法同普通液相色谱相比具有无需衍生,节约流动相和时间,操作简单,准确度和灵敏度高等优点。适用于粮食中黄曲霉毒素的快速、准确检测。

主要参考资料

[1] 化学词典

[2]王志强.高效液相色谱-柱后衍生法测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J/OL].河南预防医学杂志,2018(11):828-831[2018-10-25].https://doi.org/10.13515/j.cnki.hnjpm.1006-8414.2018.11.010.

[3]赵群,徐振斌.超高效液相色谱快速测定粮食中黄曲霉毒素含量[J].粮食科技与经济,2017,42(03):43-45.

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