背景[1-3]
BCA蛋白定量试剂盒是一种双组分、高精度、兼容去垢剂的蛋白定量试剂，可准确测定蛋白浓度。对于蛋白研究中的常见样品类型，Pierce BCA试剂均可准确测定蛋白浓度。Pierce BCA试剂可用于评估全细胞裂解物、亲和柱分离组分和蛋白样品纯化的产量，还可在工业应用中用于蛋白污染的监测。与大多数染料结合法相比，BCA蛋白定量法受蛋白质氨基酸组成差异的影响更小，因此有更高的蛋白间定量一致性。
BCA蛋白定量试剂盒
BCA蛋白定量试剂盒测定工作原理
BCA蛋白测定法是在碱性环境下，通过蛋白将Cu2+还原为Cu1+，再通过二辛可宁酸(BCA)来检测亚铜阳离子(Cu1+)。步是铜与碱性环境中的蛋白质螯合，形成浅蓝色复合物，这一过程被称为双缩脲反应。在该反应（双缩脲反应）中，由三个或更多氨基酸残基的肽在含酒石酸钠钾的碱性环境中与铜离子形成有色螯合复合物。
在显色反应的第二步中，BCA与步形成的还原型（亚铜）阳离子发生反应。两分子BCA与一个亚铜离子螯合，产生深紫色反应产物。BCA/铜复合物是水溶性的，在562 nm处具有强线性吸收，且吸收度随蛋白质浓度增加而升高。该复合物的灵敏度（检测下限）大约是个反应中淡蓝色的100倍。
反应很大程度上受到蛋白氨基酸序列中四个氨基酸残基（半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）的影响。然而，不同于考马斯染料结合法，肽链也有助于颜色形成，因此可将不同蛋白间的测量差异降至最低。
BCA蛋白定量试剂盒的特点包括：
•比色法测量—可以目测评估，也可使用标准分光光度计或酶标仪(562 nm)进行测量
•高度一致性—与染料结合法(Bradford)相比，BCA定量法的蛋白间差异更小
•兼容性强—在大多数离子型和非离子型去污剂的常见浓度下，性能不受影响
•定量时间—30分钟孵育；与传统Lowry法相比，操作更简单，且检测速度快4倍
•检测范围—BSA的线性工作范围为20至2000µg/mL
•高灵敏度—使用增强方案，可检测浓度低至5µg/mL的样品
应用[4][5]
BCA蛋白定量试剂盒可以用于溶葡萄球菌酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的异源表达与定向进化
以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为表达宿主,实现了溶葡萄球菌酶的异源表达,表达产物抑菌活性突出;进而通过随机突变和定向进化的方法,获得了活性、产量更优良的溶葡萄球菌酶。
主要研究进展如下:(1)大肠杆菌与枯草芽孢杆菌表达载体的构建。首先将溶葡萄球菌酶编码基因lss片段与表达载体p ET28a、p GJ103和p HT43通过Gibson Assembly连接,成功构建p ET28a-lss、p GJ103-lss和p HT43-lss。三种溶葡萄球菌酶重组表达质粒,分别在表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(p ET28a-lss)与枯草芽孢杆菌WB800N(p GJ103-lss、p HT43-lss)中实现了溶葡萄球菌酶的可溶性表达,表达产物对BL21(DE3)和WB800N无明显抑制作用。溶葡萄球菌酶在BL21(DE3)中的表达量比在枯草芽孢杆菌WB800N中高,约为枯草芽孢杆菌表达量的10倍,但从WB800N中的纯化方式更为简单。
(2)溶葡萄球菌酶的效价评估。利用BCA法与Western Blot对BL21(DE3)/p ET28a-lss表达体系的溶葡萄球菌酶表达量进行定性定量测定,发现该酶产量为4 mg/m L;接着通过最小抑菌浓度测定、牛津杯抑菌试验、最适温度测定等方法对该酶进行活性测定,结果表明,通过琼脂稀释法与微量肉汤稀释法得到的最小抑菌浓度结果差异较大,琼脂稀释法得到的值约为微量肉汤稀释法的4-16倍;当溶葡萄球菌酶浓度仅为4μg/m L时,即可抑制所有金黄色葡萄球菌的生长,而其对溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的杀灭能力显著低于对金黄色葡萄球菌杀灭能力的16-32倍,二者可能是由于不同菌类细胞壁的结构差异导致。在牛津杯抑菌试验中,浓度为100μg/m L的溶葡萄球菌酶对20株金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小约为2.73 mm,而同等浓度苯唑西林产生的抑菌圈难以辨认。最后,溶葡萄球菌酶的最适温度为40℃。
(3)随机突变。通过易错PCR扩增lss片段,将扩增产物与p ET28a通过Gibson Assembly连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3)获得溶葡萄球菌酶突变库。通过评价诱导时间与单克隆大小对蛋白表达量的影响,成功优化基于96孔板的溶葡萄球菌酶高通量筛选方法。挑取大小相似的突变单克隆,高通量筛选获得6个表现良好的突变体,分别为Mut-A96、Mut-A77、Mut-A92、Mut-A46、Mut-A95、Mut-A87,其中Mut-A77(H35W、V149A、S189G)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BA01611的杀菌能力比野生型更强。因此,利用定点突变的方式依次构建并表达了3个突变蛋白(Lyso(H35W)、Lyso(V149A)、Lyso(S189G)),最终发现只有3个突变位点同时存在时,才能够提高溶葡萄球菌酶对金葡菌的抑菌能力;同时Mut-A77及其3个点突变蛋白的表达量升高,约为野生型表达量的2-4倍。
综上所述,本研究成功实现了溶葡萄球菌酶在大肠杆菌BL21(DE3)与枯草芽孢杆菌WB800N中的异源表达,得到最高表达量为4 mg/m L的溶葡萄球菌酶。抑菌效价测定发现,溶葡萄球菌酶的专一性极强,当其浓度为4μg/m L时,即可抑制所有金黄色葡萄球菌的生长,分别是溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的1/16和1/32。随机突变和定向进化试验得到了一个针对金黄色葡萄球菌抑菌效果更为突出的突变体Mut-A77(H35W、V149A、S189G),并发现Mut-A77及其3个点突变蛋白的表达量均高于野生型。
参考文献
[1]Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by l-arabinose only[J].Stargardt Patrick;Striedner Gerald;Mairhofer Juergen.Microbial Cell Factories,2021(1)
[2]Therapeutic applications of lysostaphin against Staphylococcus aureus.[J].Jayakumar Jayalakshmi;Anil Kumar V;Biswas Lalitha;Biswas Raja.Journal of applied microbiology,2020(3)
[3]Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli.[J].Stargardt Patrick;;Feuchtenhofer Lukas;;Cserjan-Puschmann Monika;;Striedner Gerald;;Mairhofer Juergen.ACS synthetic biology,2020(6)
[4]The global prevalence of Daptomycin,Tigecycline,Quinupristin/Dalfopristin,and Linezolid-resistant Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci strains:a systematic review and meta-analysis.[J].Shariati Aref;;Dadashi Masoud;;Chegini Zahra;;van Belkum Alex;;Mirzaii Mehdi;;Khoramrooz Seyed Sajjad;;Darban-Sarokhalil Davood.Antimicrobial resistance and infection control,2020(1)
[5]孙彦婷.溶葡萄球菌酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的异源表达与定向进化[D].西北农林科技大学,2022.