背景[1-3]
GRTP1抗体是可以特异性结合GRTP1蛋白的一类单克隆抗体，主要用于体外检测GRTP1蛋白的Western Blot、免疫组化、免疫细胞化学、染色质免疫沉淀(ChIP)、流式细胞术、免疫沉淀和ELISA实验。
GRTP1抗体
GRTP1抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（GRTP1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CCT2抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
GRTP1抗体可以用于TDCIPP对斑马鱼胚胎发育毒性的效应评价
磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)是目前使用最广泛的有机磷阻燃剂(OPFRs)之一,在环境介质和生物组织中具有很高的检出率。先前的研究发现TDCIPP可引起斑马鱼(Danio rerio)的胚胎发育毒性。
本研究通过胚胎发育形态学、组织病理和行为学等方法研究了TDCIPP对斑马鱼胚胎发育的影响,并利用转录组测序技术进一步研究了TDCIPP对斑马鱼胚胎转录水平的影响。
主要研究结果如下:1)暴露于1000μg/L TDCIPP 120 h可引起斑马鱼胚胎发育毒性,主要表现为:胚胎发育轨迹异常、孵化率和存活率下降,仔鱼畸形率增加(心包囊水肿、躯干弯曲和尾鳍缺失等)、心率异常、生长迟缓和游泳能力降低。2)使用GRTP1抗体检测核受体(nfil3,nr2f6b,nr1d2a,cited1,foxa1,gsc)和生长因子(grtp1b,pdgfbb,eps15l1a,tgfbr3,gas2l3)相关基因的表达。1000μg/L TDCIPP暴露可导致斑马鱼胚胎的囊胚中期转换(MBT)卵裂球细胞转录激活受阻,细胞数量增加并产生不规则堆叠,编码核受体(nfil3,nr2f6b,nr1d2a,cited1,foxa1,gsc)和生长因子(grtp1b,pdgfbb,eps15l1a,tgfbr3,gas2l3)相关基因的表达紊乱。3)TDCIPP暴露可导致5.25 hpf斑马鱼胚胎的卵裂球细胞团运动性降低和胚盘高度增加,8 hpf和10 hpf外包运动卵裂球细胞迁移距离增长,外包发育延迟。这可能与膜表面调控细胞间信号传导、黏连和物质转运相关的基因(lama4,cdh5,fgf3,slc19a1,slc22a21)表达异常相关。4)TDCIPP暴露可导致斑马鱼胚胎背腹体轴分化异常,这可能与Wnt通路相关基因(gsk-3β,dvl3)表达的下调及组织者基因gsc的表达上调有关。
参考文献
[1]Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate Reduces Growth Hormone Expression via Binding to Growth Hormone Releasing Hormone Receptors and Inhibits the Growth of Crucian Carp.[J].Zhang Yongkang;Yi Xun'e;Huang Kai;Sun Qian;Kong Ren;Chen Sheng;Liang Chengqian;Li Meng;Letcher Robert J;Liu Chunsheng.Environmental science&technology.2021
[2]Mechanisms of zebrafish epiboly:A current view.[J].Bruce Ashley E E;;Heisenberg Carl-Philipp.Current topics in developmental biology.2020
[3]Progression of liver tumor was promoted by tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate through the induction of inflammatory responses in kras V12 transgenic zebrafish[J].Sheng Chen;;Yao Dang;;Zhiyuan Gong;;Robert J.Letcher;;Chunsheng Liu.Environmental Pollution.2019
[4]Large-scale distribution of organophosphate esters(flame retardants and plasticizers)in soil from residential area across China:Implications for current level[J].Jiahui He;;Jiafu Li;;Luyao Ma;;Nan Wu;;Ying Zhang;;Zhiguang Niu.Science of the Total Environment.2019
[5]肖永杰.TDCIPP对斑马鱼胚胎发育毒性的效应评价[D].华中农业大学,2022.