四肽-7（Tetrapeptide-7，Rigin，CAS：77727-17-4）是一种经典的信号类美容活性肽，核心功效为抗炎舒缓、抗糖基化、促进胶原与修复，是高端抗衰/修护配方的核心成分。常见修饰形式为棕榈酰四肽-7——在N端连接棕榈酸，大幅提升皮肤渗透性与稳定性，是化妆品中最常用形式。
然而，目前关于四肽‑7的工业化合成主要依赖于化学合成，这种合成方法副产物多、产率低、污染大、成本高，难以符合“碳中和”的时代需求。生物合成虽然能够有效解决化学合成的缺陷，但对于复杂结构的四肽‑7，目前尚未有高效的生物合成途径。而且，目前基于化学合成得到的四肽‑7的过程中往往会带来很多合成副产物，有些副产物甚至具有较大的细胞毒性，从而使得四肽‑7的生产和提纯消耗大量的成本，且容易带来严重的污染，极大地限制了四肽‑7的进一步开发与应用。因此，开发一种更加绿色经济且高效的合成方式，是 四肽‑7工业化生产所急需的。
制备方法[1]
一、Cth TerA内含肽变体的构建
Cth TerA内含肽来源自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405的TerA基因；基于噬菌体辅助连续定向进化系统(PACE)对Cth TerA内含肽原始序列进行定向进化(定向进化操作参考中国专利202210830008.5)，得到Cth TerA内含肽进化变体。
对得到的Cth TerA内含肽进化变体进行活性检测。具体步骤为：将Cth TerA内含肽进化变体序列完整插入至GFP蛋白序列中，通过观察是否能够生成完整的GFP来验证Cth TerA内含肽进化变体是否具有内含肽应具有的自切割活性(插入有外源序列的GFP无荧光，而当外源序列具有自切割活性时，其能够实现自切割效果，将自身从GFP序列中切除，从而变回完整的GFP蛋白序列，产生荧光)。以Cth TerA内含肽原始序列作为对照。
可以发现，Cth TerA内含肽进化变体组的荧光强度要显著强于Cth TerA内含肽原始序列组，说明进化后的Cth TerA内含肽进化变体相比Cth TerA内含肽原始序列具有更高的自切割效率。
二、Cth TerA内含肽进化变体在四肽‑7纯化中的应用
在Cth TerA内含肽进化变体(SEQ ID NO:3)的C端融合四肽‑7序列，分别使用酶切位点BamH I和Xho I对合成后的SEQ ID NO:6的5’端和3’端进行双酶切处理，得到酶切片段。使用的是Takara的限制性内切酶，使用方法见说明书。
使用酶切位点BamH I和Xho I对空白pET28a质粒进行双酶切处理，使用2％琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，得到线性化pET28a质粒载体。
使用T4 DNA连接酶连接酶切片段和线性化pET28a质粒载体，连接方法参考pET28a质粒使用说明或本领域中常规技术手册进行，得到含有内含肽变体‑四肽‑7融合序列的重组质粒载体pET28a‑内含肽变体‑四肽‑7(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)。
将pET28a‑内含肽变体‑四肽‑7转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态中，将转化后的大肠杆菌涂布在含卡那霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑取阳性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，震荡培养后进行测序鉴定，以确认是否转化成功。
取阳性单克隆至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8，加入1/20体积的1M Tris‑HCl缓冲液(pH8.5)和终浓度为1mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，37℃，200rpm继续培养4‑6h。4℃，10000rpm离心20min，收集菌体。收集得到的菌体用PBS清洗2次。
将洗涤后的菌体重悬在裂解缓冲液(由终浓度20mM Tris和终浓度500mM NaCl组成，pH8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至镜检染色确认没有明显的菌体。4℃，12000rpm离心20min，收集上清，0.45μm滤膜过滤，得到细胞裂解液滤液。
使用Ni‑NTA亲和层析柱用20倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的细胞裂解液滤液，以0.5mL/min流速移入Ni‑NTA亲和层析柱中，再用5倍柱体积的含20mM咪唑的裂解缓冲液充分清洗。
向Ni‑NTA亲和层析柱中再加入pH6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温孵育过夜，收集流通液，即得纯化后的四肽‑7。
参考文献
[1] 态创生物科技(广州)有限公司,广州市乾相生物科技有限公司. 一种Cth TerA内含肽变体及其在生物法制备四肽-7中的应用:CN202310189650.4[P]. 2025-10-31.