背景技术
醋酸舍莫瑞林(Sermorelin acetate)是人工合成的具有29个氨基酸的生长激索释放素,是内源性促生长激素释放激索(GHRH)的氨基末端片段,具有显著的调节生长的效应。传统的醋酸舍莫瑞林合成方法是化学法。化学合成反应高度取决于肽链序列,随着肽链的复杂性增加,方法开发和分析变得至关重要。一般来说,化学多肽合成包括保护、激活、缩合和去保护几个主要步骤。化学合成路线中主要问题包括片段的低溶解性和消旋问题。随着肽链长度的增加，杂质的种类和含量增加,杂质与最终产品的结构很相似,将大幅增加纯化难度导致最终产品成本的增加。
本文将介绍以4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯作为原料之一,制备得到的离子液体应用于多肽的合成工艺过程中,作为缩合剂能够有效的促进缩合反应的进行,制得的醋酸舍莫瑞林产品的纯度和收率明显提升,其纯度>97.5%,收率>86%。
制备方法[1]
步骤1:树脂溶胀
取C末端酰胺化序列用氨基树脂(购自天津南开合成科技有限公司),加入二氯甲烷(添加量为16mL/g树脂)振荡30min;多肽合成用仪器为SYMPHONY 12通道多肽合成仪;
步骤2:接第一个氨基酸
采用沙芯抽滤除去溶剂,加入3倍摩尔量的C端第一个Fmoc-氨基酸,接着加入6倍摩尔量的DMAP和6倍摩尔量的DCC,再加入4倍摩尔量的离子液体,最后加入DMF溶解振荡30min后,用醋酸酐封闭;
步骤3:脱保护
除去DMF后加入20%哌啶-DMF溶解(加入量为15mL/g树脂),混合5min后过滤,除去溶剂,再加入20%哌啶-DMF溶解(加入量为15 mL/g树脂),混合15min;
步骤4:检测
抽滤除去溶剂,取20粒树脂,用乙醇洗涤三次后加入茚三酮、KCN以及苯酚溶液各两滴，(108±2)℃加热5min,颜色变为深蓝色即阳性反应;
步骤5:洗树脂
依次用DMF(10mL/g)、甲醇(10mL/g)、DMF(10mL/g)各洗两次;
步骤6:缩合
取3倍摩尔量的Fmoc-氨基酸、1.5倍摩尔量的HOBt、1.5倍摩尔量的离子液体混合均匀,加入反应体系中,然后立刻加入3倍摩尔量的DIC,反应30min后,检测呈阴性;
步骤7:洗树脂
依次用DMF(10mL/g)、甲醇(10mL/g)、DMF(10mL/g)各洗两次;
步骤8:
重复步骤2至步骤6的操作,按照氨基酸顺序依次连接相应的氨基酸得到多肽;
步骤9:
将缩合完成的多肽依次用DMF(10mL/g)、甲醇(10mL/g)、DMF(10mL/g)各洗两次;抽干10min,茚三酮检测阴性;
步骤10:
脱除肽链最后N端氨基酸的Fmoc保护(操作同步骤3),检测呈阳性,溶液抽干;按照下列方法洗树脂,按照顺序依次用DMF(10mL/g)、甲醇(10mL/g)、DMF(10mL/g)、DCM(10mL/g)各洗两次,抽干10min;
步骤11:切割
从树脂上切割多肽,配制切割液(10mL/g):TFA 94%、水2%、EDT 2.5%和TIS 1.5%;将树脂装入烧瓶或者离心管中,切割液和树脂的比例按照10mL/g,恒温震荡，120min;将裂解液用氮气尽量吹干,用乙醚洗六次,常温挥干得到醋酸舍莫瑞林粗品;
步骤12:纯化
取醋酸舍莫瑞林粗品,纯水溶解,用0.45um滤膜过滤得溶解液;纯化条件:高效液相色谱仪,色谱柱为Venusi MRC-ODS C18色谱柱,规格30X250mm;流动相A液:0.1%三氟乙酸水溶液,流动相B液:0.1%三氟乙酸和乙腈;上样量30uL,流速为1.0mL/min;梯度洗脱:90%A液+10% B液,B液10%-80%,时间25min;收集从检测器出来的样品;将纯化后的溶液进行常规条件冻干,即得到醋酸舍莫瑞林。
检测
醋酸舍莫瑞林纯度：色谱柱为Venusi MRC-ODS C18色谱柱,规格4.6X150mm;流动相A液:0.1%三氟乙酸水溶液,流动相B液:0.1%三氟乙酸和乙腈;上样量10uL,流速为1.0mL/min;梯度洗脱:0~5 min:100%A液;5~30 min:A液100%-20%。
MS法鉴定多肽分子量：取纯化后样品加入水溶解,加入5%乙酸+8%乙腈+87%水溶解测试电喷雾离子化质谱测定分子量。检测得到的醋酸舍莫瑞林的分子量为:m/z[M+H]+,3358.01[1]。
参考文献
[1] 浙江湃肽生物有限公司。一种制备醋酸舍莫瑞林的方法：中国，CN202111539468.4 [P]. 2022-03-18.