简介
卡格列肽(cagrilintide，1)是一款由诺和诺德公司开发的新型长效脂化修饰胰岛淀粉素(amylin)类似物。卡格列肽由37个氨基酸组成，C末端为酰胺型，N末端的α氨基连接1个γGlu和1个二十烷二酸(C20 diacid)，其氨基酸序列为C20 diacid-γGlu-KCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP-NH2(cycl 2-7)。胰岛淀粉素通过激活位于延髓和下丘脑的特定受体，产生饱腹感，同时在非低血糖状态下抑制餐后胰高血糖素分泌，并延缓胃排空，有助于调控血糖处于稳态。
因此，研发并优化胰岛淀粉素类似物用于体质量管理和糖尿病治疗的潜力巨大。根据一项为期68周的I期临床试验报道，卡格列肽与司美格鲁肽的复方制剂CagriSema减重效果可达22.7%，并显示出良好的安全性和耐受性。目前卡格列肽的制备工艺报道较少，仅有1篇专利合成工艺。原研公司的公开专利(CN104395338A)仅报道了采用常规固相合成方法的生产工艺。
背景技术
目前，长肽的制备方法主要采用基因重组法和化学合成法。由于基因重组法所得多肽的C末端为羧基，需通过在C末端增加一个Gly，再采用肽基甘氨酸a酰胺化单加氧酶(peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase,PAM)水解Gly，以实现C末端酰胺化。因PAM成本高昂，所以C端酰胺型多肽的合成主要采用固相合成法。以往，对类似多肽的合成通常使用1-羟基苯并三唑/N,N"-二异丙基碳二亚胺作为缩合剂，而本研究拟采用爆炸风险更低、消旋化副反应更少和偶联效率更佳的2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)。本文以Rink Amide AM树脂为固相载体，Oxyma和DIC为缩合试剂，依次将Fmoc保护氨基酸与树脂偶联，得到卡格列肽树脂肽，经三氟乙酸裂解得到还原型卡格列肽粗品，再经过环化、分离、纯化、冻干得到高纯度卡格列肽。
合成方法[1]
1、树脂溶胀
称取取代度为0.28mmol/g的Rink Amide AM树脂1.0g(0.28mmol)，置多肽合成仪的反应器中，加入DMF 15mL，搅拌60min，使树脂充分溶胀，氮气鼓吹，除去溶液，剩余物用DMF 10mL洗涤(2minx2)。
2、脱Fmoc保护基
向溶胀好的树脂加入含20% PIP的DMF溶液10mL，搅拌(15minx2)后过滤;剩余物用DMF 10mL洗涤2次，再用甲醇10mL洗涤2次，最后用DMF 10mL洗涤2次。取少许树脂加入茚三酮检测试剂A 40uL和B 40uL,置沸水浴中加热5min,判断Fmoc去除程度，若树脂呈紫黑色则说明脱保护完全。
3、首个氨基酸的缩合
称取Fmoc-Pro-OH 189mg(0.56mmol,2eq)、Oxyma 120mg(0.84mmol,3eq)、DIC 106mg(0.84mol,3eq)，用DMF 10mL溶解，预活化30min，投入反应器中，在氮气保护下反应，每隔1h用茚三酮显色法检测，若树脂呈现无色或淡黄色则表示反应完全，反之则需要继续反应。
4、剩余氨基酸的缩合
缩合反应结束后，过滤除去母液，树脂用DMF 10mL洗涤1次，再用甲醇10mL洗涤2次，最后用DMF 10mL洗涤2次。根据卡格列肽的序列，从C端到N端偶联氨基酸,重复“2”项和“3”项下操作，直至全部氨基酸缩合完毕。最后用DCM 10mL和甲醇10mL交替洗涤3~6次，减压干燥24h，得到黄色树脂肽3 220mg。固相合成过程如下图所示。
5、树脂肽裂解
取干燥的树脂肽1.0g，加入裂解液(由TFA、PhOH、DODT、Tis组成，体积比为90:2.5:5:2.5)10mL，于25℃搅拌反应2h。反应液用砂芯漏斗过滤，滤液加入冷乙醚(-20℃)80mL，搅拌5min后在-20℃静置30min，离心，弃去上层清液，白色沉淀用乙醚洗涤3~6次，减压干燥。最终得白色固体(还原型卡格列肽粗肽)325mg，收率为38.56%。
6、卡格列肽的制备
取还原型卡格列肽200mg, 配制成质量浓度为10mg/mL溶液，缓慢滴入50mg/mL碘的甲醇溶液，直至溶液微黄不褪色，搅拌0.5h后滴入20mg/mL Vc水溶液至反应体系呈无色。取样，色谱条件检测，氧化0.5h时二硫键的氧化完成，得氧化型卡格列肽。C4-30nm制备柱进行一步反相HPLC纯化，最终以26.14%的路线总收率得到卡格列肽，HPLC纯度为98.00%。
参考文献
[1] 段煜,东圆珍,王成成,等. 卡格列肽的制备工艺开发[J]. 中国医药工业杂志,2025,56(8):1017-1026. DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2025.08.007.