背景及概述[1]
天然药物化学成分提取分离手册绞股蓝（Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makino.）是葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，是目前所知非五加科人参属植物中唯一含有人参皂苷类成分的植物，素有“南方人参”的美称。绞股蓝喜阴湿温和的气候，广泛分布于东南亚等地以及我国秦岭、长江以南各地区。据统计，迄今全世界的绞股蓝共有17个种和2个变种。绞股蓝皂苷（gypenoside，Gyp）是绞股蓝中最重要的功能性成分之一，因具有与人参皂苷类似的四环三萜达玛烷型基本结构而倍受关注。由于达玛烷型皂苷本身具有热不稳定性，在加热提取过程中易发生水解，因此，近年来不断有新的绞股蓝皂苷的报道，迄今已明确的绞股蓝皂苷共有165个，苷元有12类。
绞股蓝酮苷A(GypentonosideA)白色粉末状固体，mp.272℃～274℃，泡沫试验阳性，Liebermann-Burehard反应呈黄褐色，Molish反应呈棕黄色。研究表明，绞股蓝皂苷具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂、保护肝脏和神经等多方面生物活性，且其药理活性与其侧链糖基关系密切，一般绞股蓝皂苷侧链糖基分子越少其活性越高。最新代谢组学及药理学研究发现，在体内发挥药理作用的绞股蓝皂苷成分主要为含量较少的绞股蓝皂苷单体或不存在于绞股蓝中的次生苷元，值得关注的是，由于绞股蓝皂苷与人参皂苷的苷元骨架结构相同，部分绞股蓝皂苷在体内可以转化为稀有人参皂苷。因此，近年来通过生物转化对绞股蓝皂苷上的糖基进行改造以制备出活性较高的次生皂苷以及高活性的稀有人参皂苷的研究受到国内外学者及制药企业广泛关注，每年均有许多相关的研究报道。
分类[2]
迄今为止的研究发现，绞股蓝皂苷大部分具有达玛烷型的基本结构，主要由四环三萜达玛烷型皂苷苷元与糖基组成。其C20位上手性中心的绝对构型分为R-构型和S-构型，其中绞股蓝皂苷Gyp-XXXIX、Gyp-XL、Gyp-XLI、Gyp-LI、Gyp-LIII为R-构型，其余均为S-构型。随着研究的深入，越来越多的新型绞股蓝皂苷被发现，因此，为了更好地开展研究，将绞股蓝皂苷进行系地分类整理就显得尤为重要。学术界主要根据绞股蓝皂苷苷元结构的相似度对其进行分类，2011年在前人研究基础上，补充了侧链23、24位和25、26位有
共轭双键的苷元类型，将已明确的165个绞股蓝皂苷按苷元结构相似的程度划分为12类。其中，绞股蓝皂苷的达玛烯双键在24、25位的最多，有102个；侧链21、23位具有环氧结构的有13种；侧链23、24位有双键以及侧链具有21-羧酸、21，23-内酯结构的各有9种。此外，研究还发现绞股蓝皂苷的糖基大多连在C3和C20位，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖构成单糖、双糖和三糖等。随着研究的深入，越来越多的绞股蓝皂苷被发现，绞股蓝皂苷的苷元分类表也将被补充更新。
用途作用[2]
1. 抗癌作用
实验数据显示，绞股蓝总皂苷能够抑制结肠癌细胞SW620和食道癌细胞Eca-109的增殖和迁移，诱导癌细胞凋亡。而从绞股蓝总皂苷中寻找发挥主作用的皂苷单体在对癌症患者的临床治疗上更具有实用价值。研究发现，在达玛烷骨架C20位有游离羟基的绞股蓝皂苷Gyp-XXIII、Gyp-XXIV、Gyp-XXV、Gyp-XXVII、Gyp-XXVIII、Gyp-XXIX和C21位有游离羟基的绞股蓝皂苷Gyp-XXII、Gyp-XXVI对肝癌、肺癌等多种癌细胞的增续表33302018，Vol.39，No.13食品科学※专题论述殖有明显抑制作用，但对正常细胞无任何影响。Gyp-L能通过引起蛋白质的泛素化和内质网应激反应，导致二磷酸肌醇受体Ca2＋释放，最终导致人食管癌细胞、人肝细胞癌细胞死亡。
2. 降血脂作用
研究表明，绞股蓝皂苷能有效调节血脂的稳定性，治疗高脂饮食引起的高脂血症，防止非酒精性脂肪性肝病，并减少肠道对胆固醇的吸收。值得一提的是，不同含量（40%、80%、98%）的绞股蓝皂苷都能有效降低高脂血症大鼠血脂水平，且对肝组织有一定的保护作用，尤其当绞股蓝皂苷含量为98%时，改善效果更显著。绞股蓝皂苷Gyp-XVII由于其抗氧化性能，可以通过雌激素受体α介导的PI3K/Akt途径缓解动脉粥样硬化。
3. 降血糖作用
采用小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型，对糖尿病小鼠灌胃绞股蓝提取物后发现，绞股蓝皂苷对糖尿病小鼠有较好的降血糖作用，并能够提高肝糖原的合成，保护肾脏。赵涛等[73]通过探讨绞股蓝总皂苷对2型糖尿病大鼠游离脂肪酸代谢的影响及其改善胰岛素抵抗的作用机制，发现绞股蓝总皂苷可明显改善2型糖尿病中出现的胰岛素抵抗，其机制与绞股蓝总皂苷改善脂代谢紊乱和降血糖的作用有关。
4. 肝损伤保护作用
绞股蓝皂苷通过其抗氧化和抗凋亡的生物活性，有效地防止了局部缺血/再灌注诱导的肝损伤、CCl4诱导的肝纤维化。通过使用绞股蓝总皂苷，抑制2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病的大鼠血清中的血清瘦素水平的上升和脂联素水平的下降，抑制脂肪肝和肝纤维化。同时，绞股蓝皂苷通过调节肝脂肪生成过程中参与脂肪酸氧化的关键转录因子和脂肪生成酶，辅助治疗非酒精性脂肪性肝病，从而提高总体预。其中，抑制线粒体通路介导的肝细胞凋亡是绞股蓝总皂苷抗肝纤维化的重要机制之一。
5. 抗氧化作用
对不同纯化条件下（总皂苷A：30%；总皂苷B：50%；总皂苷A′：总皂苷A经硅胶柱层析后得到）得到的绞股蓝皂苷样品的体外抗氧化能力进行比较后发现，30%（体积分数，下同）乙醇溶液洗脱出的皂苷纯化样品的体外抗氧化能力最强而测定发现40%乙醇溶液分离物的抗氧化活性最强。实验结果的不同与洗脱方案不同有关，若在30%～40%乙醇溶液间增加几个洗脱梯度，可得到较准确的实验结论。基于绞股蓝皂苷显著的抗氧化活性，对绞股蓝皂苷进行皮肤的抗氧化实验，发现其具有延缓细胞衰老的作用。
6. 神经保护作用
绞股蓝皂苷具有改善抑郁症和焦虑症等神经障碍，治疗帕金森、阿尔茨海默病等神经系统变性疾病和保护视神经等作用。绞股蓝皂苷Gyp-XVII通过激活PI3K/Akt、Nrf2/ARE/HO-1通路和GSK-3β的失活，抑制β-淀粉样蛋白25～35引起的神经毒性损伤。进一步研究其潜在机制发现，Gyp-XVII通过激活转录因子EB对阿尔茨海默病的细胞和啮齿类动物模型起到保护的作用。抑郁症和焦虑症的发生与单胺类物质减少有关，绞股蓝皂苷可抑制焦虑性障碍的产生并保护由1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶缺陷而产生神经毒性的帕金森大鼠模型。此外，绞股蓝总皂苷还有防止视网膜神经节细胞凋亡、改善视神经炎患者的视力、治疗中风和促进神经干细胞分化等神经保护作用。
7.其他
绞股蓝皂苷还能改善和治疗缺血再灌注引起的大鼠心脏功能的损伤，保护心肌细胞和大脑中动脉闭塞的细胞，加速口腔溃疡的愈合、调节代谢、抗运动疲劳和增强机体免疫等。其中，绞股蓝皂苷Gyp-TN-2和Gyp-LXXIV能够抑制莨菪碱处理小鼠的记忆力和学习障碍。
制备[3]
绞股蓝皂苷的提取主要是根据极性相似相溶原理，选用对目标组分溶解度大，对不需要组分溶解度小的溶剂，并辅助一定的破壁措施将绞股蓝皂苷从绞股蓝组织细胞提取出来。目前已有报道的绞股蓝皂苷提取方法有溶剂热提取、超声波提取、酶法提取、微波提取、超临界流体萃取及超高压提取。其中超临界流体萃取及超高压提取可以作为绞股蓝皂苷提取的重点研究内容。
1.溶剂热提取
绞股蓝皂苷含有多个糖基，极性较大，可溶于水、甲醇、乙醇等溶剂，因此溶剂热提取绞股蓝皂苷时，常用水提和醇提，采取煎煮、回流提取、索氏提取等措施。水提法因其工艺简单、成本较低、无溶剂污染，而被作为粗提的常用方法，通过考察料液比、提取时间和提取温度对水提效果的影响，在化条件下绞股蓝皂苷得率为7.79%，纯度为26.85%。但水提取液中常含有无机盐、糖、蛋白质等水溶性杂质，另外水提液还常含有黏液，浓缩时易产生泡沫，给下一步浓缩分离带来困难。为了克服单纯水提的弊端，提高提取液的稳定性，采用一定质量分数的甲醇、乙醇分别提取绞股蓝皂苷，比较了80%甲醇、75%乙醇提取绞股蓝总皂苷的不同效果，通过测定发现75%乙醇和80%甲醇提取效果明显高于水提，且乙醇提取效果高于甲醇，如用乙醇回流提取绞股蓝皂苷可获得更优提取效果。
2. 超声波提取
超声波的作用是辅助溶剂提取，弥补单纯溶剂热提取破壁不理想的缺陷。超声波的空化效应及引起的一系列次级效应能实现破壁、加速提取成分的扩散释放的作用。另外，超声波也可以转化为热能加快样品中有效成分的扩散速度，从而更高效、快速提取植物细胞内容物。利用超声法提取绞股蓝皂苷，可以大大缩短提取时间，并提高绞股蓝皂苷的浸出率，且随着超声时间的延长皂苷提取率相应提高，但并不是无限提高，所以选择合适的超声时间也很重要。
3. 酶法提取
绞股蓝的细胞壁主要是由纤维素和果胶组成，而皂苷等有效成分往往包裹在细胞壁内，目前绞股蓝皂苷酶法提取工艺主要是利用纤维素酶及果胶酶破坏细胞壁组成成分，增加绞股蓝皂苷的溶出率，从而提高提取率。纤维素酶可以破坏β-D-葡萄糖苷键连接，从而使植物细胞壁破坏，减小有效成分的溶出阻力。利用纤维素酶法提取绞股蓝总皂苷，将绞股蓝粉碎至120目，酶用量0.4%、酶解温度45℃提取时间为150min、提取温度为50℃等条件下，绞股蓝总皂苷提取率为3.81%。同样采用纤维素酶提取绞股蓝总皂苷，在工艺条件下，绞股蓝总皂苷提取率达4.60%，与热水浸提法相比提取率提高了17.05%。果胶酶能够破坏绞股蓝细胞壁中的果胶物质，同纤维素酶一样有破除细胞壁加快皂苷溶出的效果。
4. 微波提取
微波提取由于能对提取体系中的不同组分进行选择性加热，因此具有较好的选择性，且热效率高、升温快速均匀，可大大提高提取物纯度，方便分离后处理。该技术大多作为辅助措施用于天然产物的水提、醇提。但微波提取应用于提取绞股蓝皂苷的文献较少，仅南昌大学的郭辉力等相对系统地研究过以微波辅助提取绞股蓝皂苷，提出了微波干法预处理-乙醇快速浸泡提取的新工艺，并与传统的乙醇回流提取进行比较，不仅提取时间缩短了近9h，提取率也提高了15.8%。此工艺较直接用溶剂浸泡进行微波辐射，能有效避免绞股蓝细胞内外同时加热与微波能被溶剂消耗而造成破壁不理想的情况出现，这样既可提高微波提取效率，节省能源，又可简化微波提取装置，降低投入成本，利于工业化生产。
5. 超临界CO2萃取
由于超临界CO2只能有效地萃取亲脂性物质，对相对质量分子较大、羟基多、极性较大的皂苷类物质提取其产率普遍较低，需要加入夹带剂、表面活性剂以及其他强化措施来提高产率。为了提高皂苷率，采用超声强化超临界CO2萃取人参皂苷，与单纯的超临界CO2萃取相比超声的加入能明显提高超临界CO2萃取人参皂苷的萃取率和生产效率，这可能是由于超声的破碎细胞壁作用导致溶质扩散阻力减小，增加了与超临界流体的接触面积。之后他又将特定的表面活性剂、乙醇和水形成反相微乳液引入到超临界CO2体系中增加对皂苷的溶解度，并与乙醇/水/超临界CO2萃取进行比较，发现其萃取率是乙醇/水/超临界CO2萃取的3.2倍。除了采取强化措施来提高超临界CO2萃取皂苷的萃取率和生产效率外，也应该注意萃取前样品的制备和预处理，比如样品粒度、样品的装填密度、样品溶液的酸碱度等都影响溶质的扩散速度和皂苷的存在形式从而影响皂苷得率及皂苷的化学结构。
6. 超高压提取
超高压提取的升压、保压、卸压过程能够加速溶剂与细胞基质间的扩散、渗透、溶解，使提取速率大大提高，提取时间大大缩短。虽然利用超高压提取绞股蓝中皂苷的文献鲜有报道，但超高压在人参皂苷提取方面的成果可以作为重要参照。在超高压技术提取人参皂苷方面成果较多，他们探讨了不同提取溶剂、溶剂浓度、提取压力、溶剂与原料比、提取时间等因素对皂苷得率的影响，并将超高压提取法与回流提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取等方法进行了比较，研究发现超高压在提取具有提取率高、溶杂少、能耗低、操作方便、快速等优点，而且超高压是在常温下操作，能程度地保留生物活性物质及各种营养成分的天然结构，避免了因热效应引起的有效成分变性、损失、药理活性降低等问题，同时超高的压力也使绝大多数细菌失活，有利于产品的保藏。另外，在一定压力下所产生的凝聚作用可以打破酶和基质间的隔离，使酶活上升，加速酶促反应。继续提高压力，既可以增加皂苷溶出率又可以改变酶蛋白的结构而起到钝酶的作用，防止内容物过多溶出，增加后续纯化的难度。超高压如果辅助酶法提取，既可充分发挥酶的催化活性，又可充分利用超高压破壁、钝酶的作用，双重作用增强破壁效果。综上可以看出，超高压提取完全可以作为绞股蓝皂苷提取的重要研究方向。虽然超高压有诸多优势，但仍面临一些实际问题，如提取工艺参数的协同效应、有限的提取容积、设备的产能、设备投资费用等。
参考资料
[1] 化学词典
[2] 绞股蓝皂苷生物转化与活性的研究进展
[3] 绞股蓝皂苷提取纯化工艺研究进展