方法一、葡萄糖母液发酵法 斜面培养 培养基制备:取葡萄糖3g,硫酸镁0.01g,磷酸二氢钾0.012g,磷酸氢二铵0.022g,蛋白胨0.025g,碳酸钙0.4g,琼脂1.5g,加蒸馏水至100ml,调节pH5.6-6.2。 将配好的培养基分装于18mm×180mm试管中,高压灭菌后,取出制成斜面,接入黑曲霉菌孢子02,于28-32℃恒温培养7d,成熟后贮于冰箱保藏备用。 黑曲霉菌02[培养基]→[28-32℃, 7d]斜面菌落 固体孢子培养 培养基制备:取麸皮100g与葡萄糖混合液(葡萄糖 5g,碳酸钙1g,常水加至100ml)143g混合均匀,分装于1L三角烧瓶中,按常规灭菌,放冷。 在无菌操作下,接入斜面孢子的悬浮液中,如青霉素钾盐(2000单位)溶液约5ml,充分混匀,分装于已灭菌的瓷盘中,盖上玻璃片,于30-32℃培养4-7d,成熟后作为固体种源。 斜面菌落[培养基]→[30-32℃, 4-7d]固体种源 种子培养 培养基配制:取葡萄糖母液(折还原糖计)5%,蛋白胨0.02%,硫酸镁0.025%,碳酸钙1.25%,磷酸二氢钾0.03%,磷酸氢二铵0.08%,加水至100%,调节pH至5.8-6.2。 在种子罐中加入计量的种子培养基,加水至规定体积,常规灭菌,冷却,通入空气,待罐温降至34℃时,移入瓷盘中的固体孢子及青霉素钾盐400000U,于30-32℃通风培养16-20h,当菌丝生长旺盛,无杂菌,糖转化率达30%以上时,即得黑曲霉种子培养液。 固体种源[种子培养基]→[pH5.8-6.2, 30-32℃, 16-20h]黑曲霉种子培养液 发酵 培养基配制:葡萄糖母液(折还原糖计)10%,碳酸钙2.9%,硫酸镁0.0156%,磷酸二氢钾0.0188%,磷酸氢二铵0.0388%,碳酸钙2.9%,加水至100%。 在配料罐加入培养基,加水至规定体积,搅拌均匀后泵入发酵罐中,搅拌,通入压缩空气,然后自种子罐压入黑曲霉种子培养液,并加入适量的青霉素钾盐抑制杂菌(2200L培养液中加入1200000U)或105-115℃半小时蒸气灭菌,于29-31℃,罐压49 kPa(0.5kgf/cm2),通气量0.3-0.5V/(V·min),搅拌培养至糖分在10-15mg/ml以下,即达终点,得发酵液。 种子培养液[培养基,青霉素钾盐]→[29-31℃]发酵液 中和、脱色 将发酵液通蒸气加热到85℃左右,出料,布袋过滤,滤液中加入新配制的石灰乳中和至pH7.2, 并于90℃加适量活性炭脱色30min, 板框过滤,得脱色液。 发酵液[石灰乳,活性炭]→[pH7.2, 90℃]脱色液 浓缩、结晶 上述滤液在60-70℃温度下减压浓缩至相对密度达1.22, 30℃左右结晶, 离心分离,甩干,粉碎,烘干,即得口服用葡萄糖酸钙。 脱色液[60-70℃, 30℃]→葡萄糖酸钙成品 方法二、淀粉糖化发酵法 斜面培养 将黑曲霉菌87孢子接入斜面培养基(制法同葡萄糖母液发酵法), 于29-30℃恒温培养7d, 成熟后接入三角烧瓶中,培养,再移入一级种子罐培养。 黑曲霉菌87[斜面培养基]→[29-31℃, 7d]斜面菌落 固体孢子培养 将麸皮100g混合与葡萄糖混合液(配方通母液发酵法)143g中,混合均匀,分装1L三角烧瓶中,按常规灭菌后放冷。在无菌操作下,接入斜面孢子的悬浮液中,加入青霉素钾盐(2000U)溶液约5ml, 充分混匀,分装于己灭菌的瓷盘内,盖上玻璃片,于30-32℃培养4-7d, 成熟后作固体种源。 斜面菌落[葡萄糖,CaCO3, 麸皮,青霉素钾盐]→[30-32℃, 4-7d]固体种源 种子培养 培养基配制:玉米淀粉糖化液(折100%还原糖汁) 100ml, 硫酸镁0.156g, 磷酸二氢钾0.188g, 磷酸氢二铵0.388g, 碳酸钙29g, 自来水加至1000ml, 调节pH至5.8-6.2。 将培养基经夹层加热至108-112℃灭菌40min, 通入过滤的压缩空气保压,降压,再加入营养盐,移入固体霉菌孢子。接种完毕, 通气搅拌培养, 控制空气内压206-245.24kPa (2.1-2.5kgf/cm2), 温度29-31℃, pH5.5-6.5, 搅拌24-26h, 使发酵原始糖从14%-15%下降到残糖0.8%以下,得种子培养液。 固体种源[种子培养基,营养盐]→[pH5.5-6.5, 29-31℃, 24-26h]种子培养液 发酵 培养基与种子培养基基本相同,其中硫酸铵代替了磷酸氢二铵。将发酵罐及其附属设备经蒸气灭菌后,加入培养基,通压缩空气,保持气压49-98kPa (0.5-1 kgf/cm2), 灭菌30-60min。 压入种子培养液,接种量4.6%, 控制中29-31℃, pH5.5-6.6, 气压196.2-245.25 kPa (2-2.5kgf/cm2), 搅拌185-195r/min, 培养24-26h, 发酵原始糖从14%-15%下降到时残糖0.8%以下为终点, 得发酵液。 种子培养液[玉米淀粉糖化液]→[pH5.5-6.6, 29-31℃, 24-26h]发酵液 中和、浓缩、初结晶 将发酵液加热至80-85℃, 杀菌及凝固菌丝蛋白,同时加入石灰乳中和pH达7-7.2, 停止加热,压滤,得澄清液,含有葡萄糖酸钙约16%-18%。加0.05%-0.2%磺化蓖麻油作消沫剂,在60-70℃、真空度72-89kPa (540-600 mmHg)下,浓缩至相对密度为1.082-1.084(90℃), 压出,放置结晶,离心,得葡萄糖酸钙粗品。 发酵液[石灰乳]→[pH7-7.2, 80-85℃]澄清滤液[磺化蓖麻油]→[60-70℃, 减压]粗品 精制、结晶、干燥 将粗品用水或葡萄糖酸钙结晶母液加热溶解, 调节至相对密度为1.082-1.084 (90℃), 按粗品量13-15g/L (1.3%-1.5%)加入活性炭脱色,调节pH6.2-6.4, 静置沉降(使悬浮杂质随活性炭沉淀)。过滤至清液,生产上往往循环过滤1.5-2h左右,80℃保温防止结晶。放料,经冷却,出口温度20-24℃, 加晶种放置结晶14-22h, 使结晶母液相对密度将至1.045-1.048 (20-24℃)离心,收集结晶,得口服葡萄糖酸钙。如此重复结晶2次,干燥,得注射用葡萄糖酸钙,收率82%, 含量99.6%。 粗品[水,活性炭]→[pH6.2-6.4, 80℃]澄清液→[20-24℃, 14-22h]口服葡萄糖酸钙→[20-24℃, 14-22h]注射用葡萄糖酸钙 注射剂的制备 取上述葡萄糖酸钙精品,加注射用水,按注射剂规定灭菌,得热源及其他均符合规定的无色的澄明液体。 葡萄糖酸钙精品[注射用水]→[灭菌]葡萄糖酸钙注射剂。 |