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河豚毒素的作用机制

发布日期:2019/12/13 7:48:16

背景及概述[1][2]

河豚大约是500种海洋有毒性鱼类中,人畜受其毒害最为常见者,如刺鲀科(Procupine fish,10种)、翻车鲀科(Sunfich,1种)、鲀科(Puffers,40种)。中国沿海分布有10余种,各地俗称“小玉斑”、“大玉斑”、“乌狼”、“䱓鲅”、“腊头”、“乘鱼”、“鸡泡”等。中国东汉张仲景(约公元200年)所著《金匮要略》明确指出河豚的毒性。后于《本草纲目》中对海洋毒素的研究,已取得显著成就。河豚体内所含的毒素。是一种多羟基全氢甲基喹唑啉的复杂化合物。元素组成大约是C10-12H15-19O8-10N3,弱碱性,无色结晶。小鼠致死剂量LD50为5×10-9-10×10-9,,对中等体重的人0.3毫克在1-2小时内即会死亡。河豚毒素一般存在于血液、卵巢、皮肤、肝脏之内。但双斑圆鲀等的肌肉内也含强毒,暗色东方鲀肾脏毒性最强。河豚毒性随季节而异,冬春之交毒性最强。幼鱼毒性不亚于成年鱼。河豚毒素稳定,盐腌、日晒、一般烧煮均不能解毒,若与无毒鱼混腌,无毒鱼亦能被其毒素污染。河豚毒素作用于神经中枢,会导致呼吸循环衰竭。河豚毒素有抗癌作用,是癌症后期的治疗药物。100千克河豚卵巢可制取河豚毒素1-2克。其提取过程是:水提取物煮沸、过滤、层析,用10%乙酸洗脱。洗脱液用活性炭吸附,再用稀乙酸洗脱,洗脱液河豚毒素结晶沉淀。

结构及性质[2]

河豚毒素(TTX)的化学研究始于1909 年,1964 年以后由Woodward 测定了TTX 的结构,1972 年Kishi 等采用化学方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子主要由3 个氮原子组成,它们与氢氧原子形成特殊的结构。其结构含有1 个碳环,1 个胍基,6 个羟基,在C—5 和C—10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”,也是世界上最致命的毒药之一。1 g 河豚毒素的毒性是1 g 氰化物的1 万倍。TTX 粗制品为棕黄色粉末,纯品为无色晶体,呈针状或菱形,无臭,无味,易吸湿潮解,不溶于无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂,微溶于水,极易溶于稀酸水溶液。TTX 在溶液中存在TTX、半缩醛型TTX、内酯型TTX动态平衡的三种结构。TTX 理化性质比较稳定,在中性和酸性条件下对热稳定,240 ℃开始碳化,但300 ℃以上也不分解。在碱水溶液中易分解,在5%氢氧化钾溶液中于80 ℃~100 ℃可分解成黄色结晶2- 氨基- 6- 羟甲基- 8-羟基-喹唑啉,这也是TTX 化学检测法的理论基础。

作用机制[2]

1982 年,美国植物学家韦德- 戴维斯发现,海地巫毒教中的回魂大师在药物中使用含有从河豚提取的毒素粉末,整个过程里中毒者大脑能完全保持清醒,如果能挺过24 h,他们就会很快恢复正常,且不会出现并发症。使人们相信他们有使人“死而后生”的能力,即所谓的“还魂术”。其实,这是由于河豚毒素的特殊结构使其像塞子一样,凝固在神经轴突的钠离子通道的入口处,阻碍钠离子透过细胞膜传导神经的冲动,从而关闭神经系统。由于河豚毒素不能越过大脑中血液细胞的屏障,因此受害者就会处于大脑清醒的无助状态之中。几小时或几天过后,当河豚毒素最终开放钠离子通道时大多数受害者已经死亡。TTX 是典型的钠离子通道阻断剂,它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表的钠离子通道受体结合,阻断电压依赖性钠离子通道,从而阻滞动物电位,抑制神经肌肉间兴奋的传导,导致与之相关的生理机能的障碍,主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明,TTX 的活性基团是1,2,3 位的胍氨基和附近的C—4,C—9,C—10 位的羟基,胍基在生理pH 值下发生质子化,形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用,从而阻碍离子进入通道。

河豚毒素能够麻痹人的肌肉和神经,而对河豚鱼自身没有影响。日本专家认为,这是因为河豚肌肉细胞的结构和人的不同,研究人员对河豚肌肉表面收容体的遗传基因进行分析,发现其中氨基酸的种类和人类的不同,河豚的这些氨基酸不与河豚毒素结合。除此以外,研究人员还发现河豚血液中有可以中和河豚毒素的蛋白质。

应用[2]

河豚毒素有着特殊结构和作用机理,引起了人们的广泛关注。神经生物学家证实微量毒液就有治疗作用。河豚毒素也可作为局部麻醉药,其局部麻醉作用比一般麻药强。国外已有将河豚毒素与普通麻药配伍作为局部麻药的专利出售。河豚毒素对癌痛的镇痛也很有效。研究人员发现癌症病人24 h 持续杜冷丁治疗收效甚微,而注射河豚毒素,每天2 次,连续3 天疼痛便缓解。河豚毒素不仅可以有效缓解晚期癌症引起的剧烈痛楚,还可治疗顽固性哮喘等。我国研究人员发现,河豚毒素还是一种戒毒良药。研究人员对吸毒者进行试验,在注射极微量的河豚毒素后,所有各种“戒毒综合症”在30 min 后全部消失。连续注射5 d 后可完全戒除毒瘾,且没有副作用。1998年,加拿大国际韦克斯技术公司利用河豚毒素成功研制成一种名为tetrodin 的戒毒新药。利用河豚毒素来戒除毒瘾,可谓“以毒攻毒”的一大创举。目前河豚在我国的养殖产量每年达到1 至1.5 万t,年产值10 至20 亿元,加工后的附加值提高5 至10 倍。但人们养殖河豚鱼仅仅限于食用,追求无毒,实际上河豚毒素的市场需求量更大,而且河豚毒素本身的特点使其价值极为昂贵。据报道每克纯度达99 %以上的河豚毒素价值高达20 万美元,甚至还有上升的趋势。一旦国家开禁,河豚未来在中国的市场将成为全球最大的市场,河豚毒素的应用前景也将更为广阔。

解毒[2]

河豚毒素的解毒现在还没有找到特异性的药物。但对于TTX 中毒者可用新鲜余甘果汁解毒。研究者将肝毒稀释5 倍注射小鼠,然后同时注射2 mL 新鲜余甘果汁,小鼠未死亡; 对照组小鼠在125 s 左右死亡。实验证明余甘果汁有解毒功效,可能是新鲜余甘果汁中的超氧化物岐化酶(SOD)起解毒功效。也可注射S- P 剂(即亚硫酸氢钠和磷酸的混合液),据研究表明河豚毒素分子中的内酯环是毒性的成因,内酯环断裂则毒性消失,S- P 试剂对内酯环有破坏作用。试验中向河豚鱼毒液中加入适量的S- P 试剂注射后的小鼠未死亡。用小鼠死亡时间评价碳酸氢钠等5 种化合物拮抗河豚毒素效果,结果表明碳酸氢钠和氢溴酸东莨菪碱对河豚毒素有明显的拮抗作用,可使小鼠100 %或80 %存活(P<0.01)。最近有多个研究表明,4- 氨基吡啶对TTX 中毒有拮抗作用。

4- 氨基吡啶的毒副作用和安全剂量范围小,能否用于临床救治还需要进一步证实。利用TTX 单克隆抗体对TTX 中毒亦具有较好的保护作用。将TTX( 5MU/mL) 与单抗在体外等体积混合,并于37 ℃孵育60 min 后再给小鼠腹腔注射,结果表明注射含0.125 mg 单克隆抗体的小鼠存活率为40 %,注射含0.25 mg 单克隆抗体的小鼠存活率达100 %。用TTX 单克隆抗体对小鼠TTX 中毒的保护作用作了进一步研究,证实这种保护作用在TTX 与抗体分别注射的情况下也存在。75 mg/kg单克隆抗体对小鼠TTX 中毒的保护率达50%。小鼠腹腔注射1.5MU TTX,3 min 后再注射克隆抗体,通过静脉,皮下,肌肉注射中和小鼠体内TTX 的单克隆抗体的半数有效剂量( ED50) 分别为2.3、5.1、9.7 mg/kg。100 μg 单抗尾部静脉注射保护率为100 %。这种与TTX 中毒相似条件下得到的研究结果充分说明了TTX单克隆抗体对小鼠TTX 中毒的保护作用,同时也预示着TTX 单克隆抗体有望成为TTX 中毒的解救剂。但由于TTX 是小分子物质,其抗体制备相对困难,临床应用受到了限制。TTX 的多克隆抗体同样对TTX 中毒有保护作用。用TTX- TTH 免疫小鼠的腹水抗体检测其中和河豚毒素的效用。证实了抗体能够在体内外有效中和河豚毒素的毒性。此抗体有望成为人类河豚毒素中毒的被动免疫保护途径。

检测[3]

除上面比较常规的方法外,国内报道的还有分光光度计法、薄层层析法、高效毛细管区带电泳法等方法。国外报道的还有柱转换液相色谱/质谱/电喷雾法、薄层层析/快原子轰击质谱法、亲水作用色谱-电喷雾质谱法、电喷雾离子化质谱法等方法,这些方法简单精确但是所需仪器设备都比较昂贵,不便于普遍推广。目前河豚毒素的检测方法多种多样,各有优缺点,应根据需要选择合适的检测方法。

制备 [2]

TTX 的提取方法主要有乙酸提取或改良乙酸提取、树脂提取和甲醇提取等。目前,我国TTX 提取常用的方法是从河豚鱼体不同部位提取纯化TTX,一般工艺流程为: 河豚鱼→水,乙酸等浸提→除蛋白质、脂类→离子交换等方法分离→脱色→活性炭吸附、聚丙烯酰胺层析等方法纯化→浓缩、精制→结晶,此法TTX的提纯难达到试剂级的高精水平。由于很多文献报道TTX 多克隆抗体能够与TTX 特异性结合,中和其毒性,因此可以考虑将TTX 多克隆抗体偶联于载体制成免疫亲和层析介质,再对TTX 进行纯化,简化其提取工艺,提高TTX 产率。由于大量捕杀河豚鱼受到资源和时空的限制,破坏了河豚鱼资源,甚至导致生态平衡的破坏,所以人们不得不另辟蹊径。根据河豚毒素的微生物起源,分离出产河豚毒素的微生物类群,通过微生物发酵来产生河豚毒素。

产TTX 的微生物类群有弧菌属(Vibrio)的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum),假单胞菌属(Pseudomonas),希瓦氏菌属的腐败希瓦菌(Shewanella putrefy aciens),交替单胞菌(Alteromonas),芽孢杆菌属(Bacillus),链霉菌属(Streptomyces),其中产毒力较高的主要是溶藻弧菌和河豚毒素互生单胞菌(Alteromonas tetrodonis)[8]。但微生物产河豚毒素产量非常低,仅为ng 级。由于其产生机制尚不清楚,提高其产量及其纯化方法也是一个难题。

主要参考资料

[1] 海洋大辞典

[2] 河豚毒素的研究进展

[3] 河豚毒素的理论及应用研究进展

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