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木瓜蛋白酶

番木瓜(Caricapapaya)为番木瓜科草本植物,原产美洲热带地区,我国广东、海南、广西、福建、台湾等省区均有栽培,为热带名果之一。其鲜果可以做果酱、果脯、饮料和罐头食品;从其青果乳汁中提取的木瓜蛋白酶粗制品,内含多种蛋白酶,有很强的分解蛋白质能力,并且有水解酰胺键和酯键的特性,广泛应用于医药、食品、纺织、制革、饲料及染料等工业,目前国际市场对木瓜蛋白酶的需要量很大。
另外,木瓜蛋白酶粗粉除含木瓜蛋白酶外,还含有木瓜凝乳酶、木瓜肽酶和溶菌酶等。木瓜凝乳酶可制造乳酪及治疗椎间盘脱出症,是很有价值的成分;溶菌酶及木瓜肽酶也有重要的用途。
木瓜蛋白酶又称木瓜酶,是一类巯基蛋白酶,广泛地存在于番木瓜番木瓜(Caricapapaya)的根、茎、叶和果实内,其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。其作用主要是对蛋白质有极强的加水分解能力,有较广的特异性对肽键的C末端有精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的均能切断,最适宜作用温度为65℃,最适pH为5~7;在中性或者偏碱性时亦有作用,耐热性强,可在50~60℃使用,90℃不会完全失活。还具有凝乳、解脂和溶菌活力,广泛地用于食品行业,如啤酒的澄清、肉的嫩化以及制革、纺织和日化用品等行业中:可用于啤酒澄清(水解啤酒中的蛋白质,避免冷藏时产生混浊),使用量0.5~5mg/kg;肉类嫩化(水解肌肉蛋白中的胶原蛋白),使用量为宰前注射0.5~5mg/kg;用于饼干、糕点松化,可代替亚硫酸盐,既有降筋效果,又提高了安全性,可使产品疏松,降低碎饼率。另外,在动、植物蛋白食品加工方面,如用于蛋白质水解产物和高蛋白饮料,可提高产品质量和营养价值,提高产品消化吸收率;在酱油酿造中加入本品和其他酶,可提高产率和氨基酸含量;在制造啤酒麦芽汁时,加入本品和其他酶,可减少麦芽的用量,降低成本,使用量为0.1%;同时,本品可作凝乳酶的代用品和干酪的凝乳剂。其分离提取方法主要有亲和层析分离法、超滤膜分离法、沉淀分离法、萃取分离法以及絮凝法等。由于此酶为纯天然产物,其开发前景越来越受到人们的重视。
木瓜蛋白酶
图1为木瓜蛋白酶

组成
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类:木瓜蛋白酶(papain)、 木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、木瓜蛋白酶 (papayaproteinase  ,也称papayapeptidase A、papayaprote inase III、car icain)、木瓜凝乳蛋白酶 M (chymopapainM,也称glycylendopeptidase、papayaproteinase Ⅳ、ProteinaseGly-C)。其中 chymopapain 的含量最多,占可溶蛋白的 45 %。其组分又最复杂 , 含十几种蛋白。但人们还是习惯根据其从离子交换柱出来的先后顺序分为木瓜凝乳蛋白酶 A和木瓜凝乳蛋白酶 B。

理化性质
纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质,相对分子质量23406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。为乳白色至微黄色粉末,具有木瓜特有的气味,稍具有吸湿性。水解蛋白质能力强,但几乎不能分解蛋白胨。最适作用温度65℃,最适作用pH5.0,易溶于水、甘油,不溶于一般的有机溶剂,等电点为8.75。

分离纯化
1.粗提:木瓜乳汁(180g)、硅藻土(100g)和筛选过的砂子 (150g) 混匀,在室温下加200~300mL半胱氨酸溶液, (0.04mol/L,pH5.7),在研钵中充分磨匀,静置后倾出上清液,再用300mL半胱氨酸溶液重复研磨和洗提,然后用半胱氨酸溶液定容到1 000mL(粗体积),用布氏漏斗过滤(0.5cm厚高岭土)。以下几步均在冷室中进行。
2.除不溶物:上述滤液在搅拌下慢慢加入1mol/L NaOH溶液调pH至9.0,离心 (2600r/min,1h) 弃去沉淀,取上清液。
3.(NH4)2SO4分级分离: 将上清液中加 (NH4)2SO4至为 40%饱和溶液,静置2h,离心(2500r/min,30min)弃上清液取沉淀,用400~500mL饱和 (NH4)2SO4溶液洗沉淀一次。
4.NaCl分级沉淀: 将上述沉淀溶于600mL半胱氨酸溶液 (0.02mol/L,pH7.0)中,慢慢加入60g固体NaCl,静置1h,离心 (2 500r/min,1h) 弃上清液取沉淀。
5.结晶:将上述沉淀在室温下溶于400mL半胱氨酸溶液中 (0.02mol/L,pH5.7) 中,立即调pH至6.5,静置30min,置于 4℃下过夜,在冷室离心 (2 500r/min,4~5h),收集结晶。
6.重结晶: 将上述结晶在室温下溶于少量蒸馏水 (蛋白酶浓度约1%)。在搅拌下慢慢加入饱和NaCl溶液(10mL/300mL蛋白溶液),当约75%的溶液加入后,木瓜蛋白酶将开始结晶,置于 4℃下过夜,收集结晶。

测定方法
1.试剂及其配制
(1)底物溶液:取65mL HCl溶液(0.3mol/L)与240mL蒸馏水混合,边搅动边慢慢加入9g血红蛋白,继续搅动45min。用 2mol/L NaOH溶液调pH至4.1。
(2)10%三氯乙酸溶液。
(3)No.605滤纸。
(4)维尔塞溶液:用蒸馏水将1mL EDTA-Na定容至1 000mL。
(5)标准木瓜蛋白酶溶液:取25mg标准木瓜蛋白酶(2 800U/ mg) 溶于维尔塞溶液,并定容至50mL。
(6)酶溶液: 用维尔塞溶液稀释,浓度约250U/mL。
2.测定
用移液管将10mL底物溶液加入一支试管中,置于31℃水浴中保温,加2.0mL酶液,振荡,保温20min后,加20mL三氯乙酸溶液终止反应。摇匀,室温下静置30min,用No.605滤纸过滤。在波长280nm处测定吸光度 (1cm光径)。
空白对照:取10mL底物与20mL三氯乙酸溶液混合,然后再加2.0mL酶液,其余步骤与上述一致。
3.计算
标准曲线的制作:用标准木瓜蛋白酶配制以下系列稀释酶液:取标准木瓜蛋白酶溶液分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL,用维尔塞溶液定容至2.0mL。
将上述各组试液于31℃下保温20min后,按测定步骤“进行操作,以酶浓度对A280nm作标准曲线。
在上述试验条件下,A280nm改变0.001所需的酶量定义为一个酶单位 (U)。

贝伐单抗
式中试液酶单位从标准曲线上查得的数值。

应用
木瓜蛋白酶广泛地用于轻纺、啤酒、食品、化工及日用品以及医药行业。
1.在食品行业中的应用
(1)在豆类食品中的应用:采用木瓜蛋白酶来改善大豆蛋白的理化性质效果良好,改性产品口味较好,适宜于大豆蛋白改性,但由于其酶水解效率较低、易失活。为充分发挥木瓜蛋白酶的水解效率,添加半胱胺酸、亚硫酸钠、异 Vc 钠等添加剂对木瓜蛋白酶的保护作用。
(2)在肉类食品中的应用:木瓜蛋白酶是半胱氨酰基蛋白酶,能降解胶原纤维和结缔组织蛋白质,它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成为小分子的多肽甚至氨基酸,令肌肉肌丝和筋腰丝断裂,使肉类变得嫩滑,并简化蛋白质结构使人体食用后易于消化吸收。
(3)在啤酒工业中的应用:木瓜蛋白酶的加入会使酒体高分子氮明显降低,中小分子氮含量有所增加。随着酶添加量的提高,总酸会有所升高,泡持力有所下降。因此采用蛋白酶作为啤酒稳定剂,另外,还被广泛应用于啤酒清洁生产。
(4)饼干松化剂:在生产饼干时,当面粉的面筋含量很高的情况下,可以使用蛋白酶来降低面筋的强度,提高面团的可塑性。可使产品易成型并准确压花。蛋白酶可增加饼干面团的伸展性,提高面团的操作性能和产品质地。蛋白质分解产生的氨基酸还有利于烘烤时发生美拉德反应,使制品的口感风味有所改善。蛋白酶可以破坏面筋结构,从而使产品外形容易控制,产生较好的酥性,同时还可以促进美拉德反应改善饼干产品颜色
2.在壳聚糖中的应用:木瓜蛋白酶价格便宜且稳定性好,对壳聚糖的降解效率高,因而很有工业化前景。
3.在医药中的应用
(1)可以清除挫伤、切断伤、烫伤等各种皮肤表面的溃疡,而对健康组织无影响。
(2)做成肠溶片,口服以达到消炎、消肿的目的,也可用于驱除肠道寄生虫,或用木瓜蛋白酶水解动植物蛋白,得到可供病人服用的水解蛋白。
(3)可以促进中药成分的有效煎出。
(4)可以用于辅助 R h 血型的鉴定。经木瓜蛋白酶处理的红细胞,其表面电荷降低,相互之间的斥力下降,凝聚反应更容易发生。
(5)可以催化合成多种药物及其前提物质。如短肽、喜树碱的合成。
(6)用于关节炎实验模型的建立。
(7)可用于肿瘤的辅助治疗。 在化疗期间口服木瓜蛋白酶可以降低化疗的副作用而增强化疗的疗效。
(8)将木瓜蛋白酶中分离纯化得到的 chmopapain可以用于治疗腰椎间盘突出症。
(9)与其它药物配合使用可以用于治疗骨外伤和痔瘘病患等具有良好效果。还可用于处理坏死组织、治疗湿疹等多种疾病。
4.纺织工业:用木瓜蛋白酶处理过的羊毛,可使毛线手感柔软,舒适、抗收缩、抗张强度等效果收缩性为0;还可用于蚕的脱胶和蚕丝的精炼。
5.皮革工业:利用木瓜蛋白酶制成皮的脱毛剂,鞣制皮革,使毛孔细致光亮。
6.饲料工业:分解饲料中蛋白质成氨基酸,增加营养物质的渗出量,利于家禽对蛋的吸收和利用,同时补充动物内源酶不足,提高饲料利用率及降低饲料成本,增强食欲。
7.日化行业:用于香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等,去污力强。
8.化妆品行业:木瓜酶作用于人体皮肤老化角质层,促使其分解退化、去除达到嫩肤效果及促进细胞生长的效果;其水解物在皮肤表层形成一层氨基酸衍物薄膜,使肌肤保持润湿与光滑;易与形成色斑的黑色素中铜离子形成络合物,减少黑色素的形成。

【主要参考资料】
http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB6135333.htm
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[2] 吴显荣. 木瓜蛋白酶的开发与应用. 中国农业大学学报,2005, 10(6): 11-15
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[4] 中国食品添加剂生产应用工业协会 编著;刘志皋 主编.食品添加剂手册.
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[7] 宁正祥 主编.食品成分分析手册.北京:中国轻工业出版社.1998.第703-706.
[8] 熊华.木瓜蛋白酶的应用研究进展.四川食品与发酵.2005,4:9-11.

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